Summary
先天性横隔膜ヘルニアおよび胎児気管閉塞の様々な動物モデルは、倫理的問題、コスト、外科的困難、大きさ、生存率、および遺伝的ツールの入手可能性に関する長所と短所を提示する。このモデルは気管閉塞および上昇した発光圧力が肺の発達に及ぼす影響を調べるための新しいツールを提供する。
Abstract
確立された治療モダリティである胎児気管閉塞(TO)は、重度の先天性横隔膜ヘルニア(CDH)における胎児の肺の成長および生存を促進する。TOに続いて、分泌された上皮液の保持は、光圧を増加させ、肺の成長を誘発する。CDHとTOの病態生理を理解するために、様々な動物モデルが定義されている。技術の難しさ、動物の大きさ、コスト、高い死亡率、遺伝的ツールの入手可能性など、すべての利点と欠点があります。本明細書において、マウス胎児TOの新規経子宮モデルについて説明する。妊娠中のマウスを麻酔し、子宮は正中腹腔内切断術を介して露出した。選択された胎児の気管は、気管の後ろに配置された単一の経子宮縫合糸、1つの頸動脈および1つの頸静脈で結紮された。ダムは閉鎖され、回復を許された。胎児は分娩の直前に集められた。TO胎児の体重に対する肺比は、対照胎児のそれよりも高かった。このモデルは、TOと肺の発達に対する発光圧力の増加の両方の影響を研究するための新しいツールを研究者に提供します。
Introduction
先天性横隔膜ヘルニア(CDH)は、1:2500の妊娠で発生し、肺の低形成および新生児肺高血圧症の結果1、2、3、4、5、6。胎児気管閉塞(TO)は、バルーンがカリナのすぐ上に配置され、第32期の妊娠週に除去される26-30日の妊娠週に胎児鏡検査を伴う重度のCDH患者における確立された出生前療法である。この一時的なTOは、胎児の肺の成長を誘発し、生存を改善する。先天性高気道閉塞症候群は肺過形成に関連する致死的な状態であり、外科医は分泌された上皮液の保持を促進するために気管の人工閉塞を行うよう促した。この閉塞は、光圧を増加させ、肺の成長を誘発した7.しかし、上皮細胞成熟を可能にするために、閉塞を逆転させるべきである。
CDHおよびTOの様々な動物モデル-オビン、ウサギ、ラットおよびマウス−CDHおよびTOの病態生理を理解するために開発された。技術の難しさ、動物の大きさ、コスト、高い死亡率、遺伝的ツールの入手可能性など、すべての利点と欠点があります。オビンモデルに使用される外科技術は、人間で使用されるものと非常によく似ており、逆転することができますが、このモデルの主な欠点は、動物の費用、長い妊娠期間、および可能な限られた手術の数です。ウサギモデルは妊娠期間が短く、羊モデルよりも安価です。しかし、ウサギモデルは不可逆的な8、9です。マウスモデルは、最も低コスト、妊娠1人当たりの胎児の数が最も多く、最も特徴付けられるゲノムであり、細胞および分子分析のために広く利用可能なツールを有する。ただし、重要な欠点は、TOの可逆性の欠如であり、TOの影響を完全に理解できないことです。本明細書では、前述のモデルのすべての利点を組み合わせ、容易で、可能な可逆性、および低侵襲げげっ歯類TOモデルを作成する方法を提示する。
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Protocol
すべての実験は、実験動物のケアと使用のための国立衛生研究所ガイド(NIH出版物第80023号、改訂1978)に準拠しています。この手続きは、シンシナティ小児研究財団施設動物ケアおよび使用委員会によってIACUCプロトコル#2016-0068で承認されました。
1. 準備
- 年齢に一致した野生型(WT)C57BL/6マウスを交尾するには、同じケージの6:00 p.mに置き、翌日の9:00.mに分離します。
- 胚性0日目(E0)を決定するには、膣壁に均質な外帯が付いており、繊維状で、プラグ材料の繊維と混合した塊を形成するいくつかの精子を含む膣プラグを見てください。
- 交配時のマウスの体重を記録する。
- E10上のマウスの重さを再検討し、継続的な妊娠を確実にする。
- E16.5(早期の運河段階)で手術を行います。
- 手術中に使用される器具を滅菌:はさみ、針ホルダー、鉗子、クランプ、外科用ナイフおよびハンドル。
- 手術プラットフォームを24°Cに予熱し、手術前に温かい生理焼群(24°C)を準備します。
- 回復のための暖かい環境を作成し、早期給餌のためにケージの中に湿った食べ物を残します。
- 彼らは自分自身を養うことができるまで、操作された動物と一緒に滞在。
- 手術後、手術したマウスを個々のケージに一人で入れておく。
2. 麻酔
- 手順の1時間前に妊娠ダムにブプレノルフィンの皮下0.1 mg /kgを適用します。
- 吸入したイオブルランの5 mL/hを、麻酔の手順中に連続して2 mL/hを使用してください。
- 妊娠中のマウスのあごの動きを監視します。
3. 腹腔内術
- アルコールとポビドネヨウ素で腹部の表面をきれいにします。操作を通して無菌状態を維持する。
- 妊娠したダムの開腹術のために垂直切開を行う。すべてのレイヤーを個別にカットします。
- 両側の子宮の角を識別します。
- 手術の候補胎児を決定する。
注意:膣に最も近い胎児を操作しないでください。 - 各側に偶数の胎児がある場合は各子宮角の2つの胎児(ほとんどの場合4)、子宮の奇数がある場合は各子宮角の1胎児(3ほとんどの場合)を操作します。
4. 気管閉塞
- 視覚化には 2.5 倍の倍率メガネを使用します。
- 子宮ホーンを横断的に配置します。
- 胎児を配置するためのガイドとして、子犬と尾の目を使用して、2本の指の間を上向きに見て、子犬を取ります。
- 頭の延長を可能にするために、子犬の頭に穏やかな圧力を適用し、したがって、首の可視化。
- 外傷性の針を持つ6.0ポリプロピレン縫合糸を使用してTOを実行します(図1)。胎盤を針の入口と出口から遠く離れて横に置いてください。
- 頸部の1/3番目 の前部を通して胎盤から離れて子宮の側面を通して針を横に挿入します。
- 針を首の中線までそっと動かし、前部に向け、気管の間の首を出て頸動脈鞘と子宮の反対側に向けます。
- 縫合糸を結び、膜と子宮壁の完全性を維持し、結び目の間に臍帯を安全に保つように注意してください。
図1:気管閉塞(A)頸部を通過する経子宮縫合。(B) 縫合糸が通過した後、結び目の前の構造物の概略表現。略語: C = 頸動脈;J = 頸静脈;T =気管;E = 食道;V = 椎骨。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
5. 腹壁閉鎖
- 腹部の子宮ホーンを交換してください。
- 閉鎖前に腹膜腔に2mLの温かい滅菌生理液を注入する。
- ランニング5/0ポリグラクチン縫合糸を腹壁を閉じ、非走りシルク縫合糸で皮膚を閉じます。
- 鎮痛のために0.1mg/kgのブプレノルフィン腹腔内を塗布し、温かい保育器でダムの回収を可能にする。
6. 収穫
- 妊娠中のダムに麻酔をかけ、帝王切開でE18.5ですべての胎児を収穫する。
- 胎児の動きを見て胎児の生存率を確認する。
- 安楽死のために少なくとも2つの異なる技術を使用してください:二酸化炭素の不足と子宮頸部転位。
- 獣医学の規則に従ってボディを取り除く。
- すべての胎児の重量を量る。
- 胸郭に垂直切開を行い、肺を除去する胸部切開術を行う。
- 胚の肺を解剖し、体重に対する全肺(LBWR =(左肺体重+右肺体重)/体重x100を計算するためにそれらを量る。
7. ヒストロジー
- 液体窒素、最適な切断温度化合物、およびドライアイスで組織をスナップフリーズします。
- クライオスタットを使用してサンプルを10μmのセクションに切り、ポリリジンコーティングされたスライドに取り付けます。
- スライドを一晩60°Cで焼き、ホウフィールド顕微鏡を使用して10〜20倍の倍率で画像取得のために取り付ける前に、ヘマトキシリンとエオシンで焼いたスライドを汚します。
8. タンパク質・DNA解析のための組織処理
- 解剖した胎児肺を凍結し、300 μLの放射性免疫沈殿アッセイバッファーで均質化する。遠心分離機 4 °C で 5 分 18,000 × g.
- タンパク質、DNA、およびRNA10、12を抽出して定量する。
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Representative Results
この研究は37人の胎児を調べた:20(54.1%)TO対17 (45.9%)コントロールとして。気管はTO群の4人の胎児で閉塞することができなかったので、彼らは研究から除外された。両群の死亡率に有意差はなかった:4人の胎児(25%)TO群および2人の胎児(12%)対照群 (p=0.334、オッズ比(OR)2.5、95%信頼区間(CI) 0.39-16.05)。平均体重、肺重量、および肺対体重比(LBWR)は、対照群よりもTO群において高かった(表1)。TO グループと制御グループの間には LBWR (p=0.006) に大きな違いがありました。
DNA、RNA、およびタンパク質を定量し、LBWRにおける差の理由を決定した(図2)。肺DNA量とDNA/タンパク質比はTO群において高く、肺RNAでは差が認められず、かつ、上記対照群よりもTO群ではタンパク量が低く、上皮性過形成が指摘されたウサギTOモデルにおいて以前に認められたように12。TO群の気道の直径も増加を示した。
E18.5肺の組織学的分析は、制御サンプル中の上皮表面間に空域および肥厚した間質を発達させ、TO群の肺が主観的に高い核を有する中央および遠位気空間を拡張した肺発達の後期および初期の嚢胞段階を示した(図2)。この増加した細胞性は、肺癌の量の指摘された増加と一致する。
図2: グループの機能(A)正常化された肺から胎児の体重比、(B)肺DNAとタンパク質比、(C)肺のDNA含量を肺体重に正規化し、(D)肺のRNA含有量を肺重量に正規化し、(E)肺タンパク質含有量を肺重量に正規化した。(F)C57BL/6 E18.5肺の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン画像(スケールバー= 50μm)および胎児経子宮口気管閉塞(G)は、気道伝導の過形成および遠位気空間の増加を示す;スケールバー= 100 μmコントロール(n=9)と気管閉塞(TO)(n=6)の比較は、学生のt-testを用いて行った。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 表1:グループの形態測定結果 | |||
| 宛先 | コントロール | p | |
| 胎児の体重 (mg) | 1100.52 ± 229.38 | 1087.15 ± 172.32 | 0.896 |
| 肺の重量 (mg) | 28.41 ± 5.87 | 23.38 ± 3.09 | 0.043 |
| LBWR | 0.0259 ± 0.0021 | 0.0217 ± 0.0028 | 0.006* |
| 標準偏差±平均で表される値。略語: LBWR = 肺から胎児への体重比;TO = 気管閉塞。 | |||
| *95% 信頼区間 0.0222-0.0249.学生のt検定による比較グループ。 | |||
表1:グループの形態測定結果
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Discussion
この方法は、マウスにおける胎児気管閉塞の外科的処置および肺の発達への影響を説明する。プロトコルには、TO を成功させるために慎重に実行する必要がある重要な手順がいくつかあります。手術が行われるプラットフォームの暖かさと腹腔に導入された生理液は、妊娠の進行にとって非常に重要です。さらに、首の露出を確実にするために、子犬の頭部にわずかな圧力を加える必要があります。
6.0ポリプロピレン縫合は、この技術に使用できる唯一の縫合糸です。6.0より大きい縫合糸の針は厚く、首の気管の周りの構造を破壊し、胎児の喪失をもたらす。細い縫合糸の針は非常に短く、E16.5子犬(初期の運河段階)の首を通過することはできません。また、切断針は隣接する構造物を破壊する可能性があるため、適切ではありません。
このモデルには、いくつかの制限があります。まず、マウスとヒトの間の肺の発達段階と妊娠期間の相関関係に違いがある。第2に、マウスでCDHを開発することは困難であり、最後に、マウスモデルでは血行力学研究が行いにくい。しかし、この研究の短い学習曲線は、胎児死亡率の劇的な減少をもたらした。前述のように、動物のコストだけでなく、その維持、妊娠あたりの胎児の数、妊娠期間の長さ、および遺伝的ツールの限られた入手可能性は、ウサギと羊のモデルの主な制限要因です。
このマウスモデルの第一の利点は、TOの子宮摘出術の必要性を排除し、この研究で観察された低死亡率を占める子宮内で逆転する可能性を有することです。第二に、動物のコストの削減とその維持および短い妊娠期間は、より広い範囲の実験を促進する。第三に、低体温症や麻酔などの合併症の非技術的原因は、手術の短い期間によって予防される。最後に、マウスで利用可能な多種多様な遺伝的ツールは、CDHの病態生理を理解するためのより多くの研究につながります。CDHのニトロフェンおよびノックアウトモデルにおける胎児の生きた誕生による経子宮縫合糸の除去は、この技術の将来の応用となるだろう。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、公共、商業、または非営利セクターの資金調達機関から特定の助成金を受け取りませんでした。すべての著者は、データの研究、取得、分析、解釈の概念と設計に多大な貢献をし、記事を起草し、重要な知的コンテンツと提出するバージョンの最終的な承認のためにそれを改訂しました。著者らは、手術技術のアートワークの制作に彼の親切な努力のためにCan Sabuncuooğleに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | For regional anesthesia |
| Isoflurane | Halocarbon Life Sciences | NDC 66794-017-25 | For general anesthesia |
| Magnification glasses | USA Medical-Surgical | SLR-250LBLK | At least 2.5x |
| Nikon 90i microscope | Nikon | 3417 | Motorized Fluorescence |
| Nucleospin Tissue Kit | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 740952.5 | DNA isolation |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher, IL, USA | 23225 | Protein quantification |
| Polyglactin suture | Ethicon | VCP451H | 4-0, 24 mm, cutting |
| Polylysine slides | VWR | 48382-117 | Microscope adhesion slides |
| Polypropylene suture | Ethicon | Y432H | 6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | R0278-50ml | Protein isolation |
| Silk suture | Ethicon | VCP682G | 4-0, 24 mm, cutting |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation |
References
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