Akış ve Esneme Altında Biyomalzemelerin Enflamatuar ve Rejeneratif Kapasitesini Değerlendirmek için Çok İşaretli Bir Biyoreaktör

Summary

Bu protokolün amacı, kesme stresi ve döngüsel esnemenin birleşmesini sağlayan bir biyoreaktör kullanarak, malzeme güdümlü doku yenilenmesini araştırmak için tübüler elektrospun iskelelerinde insan makrofajları ve miyofibroblastların dinamik bir ortak kültürünü yürütmektir.

Abstract

Resorbe edilebilir biyomalzemelerin doğrudan vücutta yenilenmeyi teşvik etmek için kullanılması, çevirisel açıdan çekici bir stratejidir. Bu tür malzemeler implantasyon üzerine enflamatuar bir yanıta neden olur, bu da malzemenin daha sonra emilmesinin ve yeni dokunun yenilenmesinin sürücüsüdür. Yerinde doku mühendisliği olarak da bilinen bu strateji, doku mühendisliği vasküler greftler gibi kardiyovasküler yedekler elde etmek için izlenmiştir. Hem enflamatuar hem de rejeneratif süreçler, iskeledeki lokal biyomekanik ipuçları (yani, esneme ve kesme stresi) ile belirlenir. Burada, borulu bir iskelede streç ve kesme stresinin ayrıştırılmasını benzersiz bir şekilde sağlayan özel olarak geliştirilmiş bir biyoreaktörün kullanımını ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu, insan makrofajları ve miyofibroblastları kullanarak dinamik bir ortak kültür deneyine dayanarak gösterdiğimiz iyi kontrol edilmiş mekanik yüklerin etkisi altında tübüler iskelelerin enflamatuar ve rejeneratif kapasitesinin sistematik ve standart olarak değerlendirilmesine izin verir. Bu yaklaşımdaki temel pratik adımlar (biyoreaktörün inşası ve kurulması, iskelelerin ve hücre tohumlamanın hazırlanması, streç ve kesme akışının uygulanması ve bakımı ve analiz için numune hasadı) ayrıntılı olarak ele alınmıştır.

Introduction

Kardiyovasküler doku mühendisliği (TE),^1,2,3,4hastalarının büyük kohortları için yetersiz olan şu anda kullanılan kalıcı kardiyovasküler protezlere (örneğin, vasküler greftler, kalp kapak değiştirmeleri) alternatif bir tedavi seçeneği olarak takip edilmektedir. Çok aranan uygulamalar arasında doku mühendisliği yapılmış vasküler greftler (TEVG'^{ler) 5,6} ve kalp kapakçıkları (TEHV' ler)^7,8bulunur. Çoğu zaman, kardiyovasküler TE metodolojileri, oluşacak yeni doku için öğretici bir iskele görevi gören yeniden sıralanabilir biyomalzemelerden (doğal veya sentetik) yararlanır. Yeni doku oluşumu tamamen in vitro olarak mühendislik yapılabilir, implantasyondan önce bir biyoreaktörde (in vitro TE) 9^,10^,11veya doğrudan in situ, sentetik iskelenin doğrudan vücutta yeni doku oluşumunu teşvik etmek için ön kültleme yapılmadan implante edildiği hücreli ve kültlü iskeleyi tohumlayarak (yerinde TE)^12,13,14. Hem in vitro hem de in situ kardiyovasküler TE yaklaşımları için, başarılı fonksiyonel rejenerasyon baskın olarak hem implante yapıya konak immün yanıtına hem de uygun biyomekanik yüklemeye bağlıdır.

Kardiyovasküler TE için biyomekanik yüklemenin önemi iyi kabul edilir¹⁵. Kardiyovasküler implantlarda, iskeleyi dolduran hücreler hemodinamik ortamın bir sonucu olarak ortaya çıkan döngüsel esneme ve kesme streslerine maruz kalır. Çok sayıda çalışma, (döngüsel) esnemenin kollajen16 , 17 , 18^,19,glikozaminoglisekanlar (GAG) 20 ve elastin^21,22gibi matris bileşenlerinin oluşumu üzerindeki uyarıcı etkisini çeşitli hücre tiplerine göre bildirmektedir. Örneğin, Huang ve ark. biaksiyel streç bir vasküler biyoreaktör kullanarak in vitro TEVGs kollajen ve elastin birikimini ve organizasyonununu yükselttini göstermiştir²³. Vurgu tipik olarak baskın yük olarak esnemeye dayansa da, bu çalışmalar genellikle numunenin kesme akışına da maruz kaldığı akış tahrikli biyoreaktörlerden yararlanır. Kesme gerilmelerinin 3D doku oluşumu ve iltihaplanma üzerindeki izole etkisi hakkında nispeten az şey bilinmesine rağmen, bazı veriler mevcuttur. Örneğin, Hinderer ve ark. ve Eoh ve arkadaşları, 3D iskele mikro yapısına ek olarak, in vitro model sistemde insan damar düz kas hücreleri tarafından olgun elastin oluşumu için önemli olduğunu göstermiştir^24,25. Bu bulgular, kardiyovasküler TE için hem döngüsel esneme hem de kesme stresinin alaka düzeyini göstermektedir.

TE implantlarının başarısı veya başarısızlığı için bir diğer önemli belirleyici, konağın implante grefte immün yanıtıdır²⁶. Bu, hücresel akın ve endojen doku oluşumu ve yeniden şekillendirme²⁷sonraki süreçlerini başlatmak için iskeleye akut enflamatuar yanıta dayanan malzeme odaklı in situ TE stratejileri için özellikle önemlidir. Makrofaj,²⁸,^29,30gibi birden fazla çalışma ile gösterilen fonksiyonel doku yenilenmesinin kritik bir başlatıcısıdır. Yara iyileşmesine benzer şekilde, dokunun yenilenmesi makrofajlar ve fibroblastlar ve miyofibroblastlar^{31, 32,}33 gibi doku üreten hücreler arasında parakrin sinyal ile yönetilir. Yeni doku birikimini koordine ederek, makrofajlar yabancı iskele malzemesi^34,35'inaktif resorpsiyonunda yer almaktadır. Bu nedenle, bir biyomalzeme in vitro makrofaj yanıtı, implantların in vivo başarısı için tahmine dayalı bir parametre olarak tanımlanmıştır^36,37,38.

İmplante edilmiş bir iskeleye makrofaj yanıtı, malzeme bileşimi ve mikroyapı^{35, 39,40}gibi iskele tasarım özelliklerine bağlıdır. İskele özelliklerine ek olarak, bir iskeleye makrofaj tepkisi ve myofibroblasts ile çapraz konuşmaları da hemodinamik yüklerden etkilenmiştir. Örneğin, döngüsel streç makrofaj fenotip^{41 , 42,43,44}ve sitokinlerin^{salgılanması önemli} bir modülatör olarak gösterilmiştir^43,44,45,46 3D elektrospun iskelelerde. Makrofajlar ve vasküler düz kas hücrelerinden oluşan bir ortak kültür sistemi kullanan Battiston ve arkadaşları, makrofajların varlığının elastin ve GAG seviyelerinin artmasına yol açtığını ve orta derecede döngüsel esneme seviyelerinin (1.07-1.10) kollajen I ve elastin^47'ninbirikmesini uyardığını göstermiştir. Önceki çalışmalarda, kesme stresinin 3D elektrospun iskeleleri^48,49'a monosit alımı için önemli bir belirleyici olduğunu ve hem kesme stresinin hem de döngüsel esnemenin insan monositleri ve mezenkimal stromal hücreler arasındaki parakrin sinyali etkilediğini gösterdik⁵⁰. Fahy ve arkadaşları, kesme akışının insan monositleri tarafından pro-enflamatuar sitokinlerin salgısını artırdığını göstermiştir⁵¹.

Birlikte ele alındığında, yukarıdaki kanıtlar hemodinamik yükler üzerinde yeterli bir anlayış ve kontrolün kardiyovasküler TE için çok önemli olduğunu ve bunu başarmak için enflamatuar yanıtın göz önünde bulundurulmasının önemli olduğunu göstermektedir. Daha önce in vitro52 , 53 , 54 ,^55,56,57,58veya ex vivo^{59,60 ,61}kardiyovasküler doku kültürü için çok sayıda biyoreaktör tanımlanmıştır. Bununla birlikte, tüm bu sistemler fizyolojik hemodinamik yükleme koşullarını mümkün olduğunca taklit etmek için tasarlanmıştır. Bu, kardiyovasküler dokuların in vitro olarak oluşturulması veya ex vivo kültürlerinin korunması amacıyla son derece değerli olsa da, bu tür sistemler bireysel ipuçlarının bireysel etkilerine sistematik çalışmalara izin vermez. Bunun nedeni, bu biyoreaktörlerde hem döngüsel esneme hem de kesme stresinin uygulanmasının, özünde onları bağlayan aynı basınçlı akış tarafından yönlendirilmesidir. Doğru çok işaretli mekanik manipülasyona izin veren mikrosistemler 2D substratlar⁶² veya 3D hidrojel kurulumları⁶³,⁶⁴için açıklanmış olsa^da,bu tür kurulumlar elastomerik 3D biyomalzeme iskelelerinin birleştirilmesine izin vermez.

Burada, kesme stresi ve döngüsel esnemenin ayrışmasını benzersiz bir şekilde sağlayan ve bireysel ve kombine etkilerini mekanistik olarak araştırmaya yardımcı olan bir tübüler biyoreaktör sisteminin uygulanmasını sunuyoruz. Bu sistem, çok çeşitli doku mühendisliği vasküler greftlerin (örneğin sentetik veya doğal kökenli, farklı mikro mimari, çeşitli gözeneklilikler) testine izin verir. Kesme gerilme ve germe uygulamasını etkili bir şekilde ayrıştırmak için, biyoreaktörün kullandığı temel kavramlar (1) ayrı pompa sistemleri kullanılarak kesme stresi ve esneme kontrolünün ayrılması ve (2) iskelelerin hesaplama odaklı boyutlara sahip 'içten dışa' bir şekilde uyarılmasıdır. Akış, borulu iskelenin dış yüzeyine bir akış pompası kullanılarak uygulanırken, iskelenin çevresel gerilmesi, iskelenin ayrı bir gerinim pompası kullanılarak monte edildiği silikon bir tüp genişletilerek indüklenmiştir. Silikon tüpün boyutları ve yapıyı içeren cam tüp, iskeledeki kesme stresinin (akış nedeniyle) ve çevresel germenin (tüp genişlemesi nedeniyle) birbirini önemli ölçüde etkilememesini sağlamak için hesaplamalı akışkan dinamiği simülasyonları kullanılarak özenle seçilir ve doğrulanır. Bu içten dışa tasarımın birkaç pratik mantığı vardır. Streç, ışık sıvısı basıncı (fizyolojik yüklemeye benzer) tarafından uygulanırsa, doğal olarak numune tasarımının sızdırmaz olmasını gerektirir. Ek olarak, numuneyi germek için gereken basınç, numuneler arasında ve zaman içinde bir numune içinde değişebilen numune sertliği tarafından tamamen belirlenir ve bu da esnemeyi kontrol etmeyi zorlaştırır. Bu biyoreaktör, doku mühendisliği yapılan grefti silikon bir tüpün etrafına monte eder ve greftin dış duvarında duvar kesme stresi (WSS) uygulamasına izin verir ve grefti içeriden basınçlandırır. Bu şekilde, numuneler arasında ve zaman içinde numuneler içinde eşit yükleme koşulları sağlanabilir ve dahası, gözenekli vasküler iskelelerde yaygın olduğu gibi numunelerin sızdırılmasına izin verilir¹⁹. Bu içten dışa biyoreaktör, geleneksel vasküler biyoreaktör kurulumlarının daha uygun olduğu doğal benzeri bir kan damarı in vitro mühendisliği yerine, kesme ve/ veya esnemenin etkileri üzerine sistematik çalışmalar için özel olarak tasarlanmıştır. Biyoreaktör tasarım çizimleri için Şekil 1A–B'ye ve biyoreaktörün ana bileşenlerinin arkasında işlevsel bir açıklama ve rasyonellik için ilgili Tablo 1'e bakın.

Biyoreaktör kullanımı, grubumuz tarafından, yerinde kardiyovasküler doku için resorbable elektrospun iskelelerinde kesme stresi ve döngüsel streçlerin iltihaplanma ve doku oluşumu üzerindeki bireysel ve kombine etkilerini araştırdığımız bir dizi yeni çalışmaya dayanarak gösterilmiştir^19,43,44. Bu amaçla, in situ rejeneratif çağlayanın çeşitli aşamalarını simüle etmek için mono veya ortak kültürde insan makrofajları ve miyofibroblastları kullandık. İnsan makrofajları tarafından sitokin salgılamanın hem döngüsel streç hem de kesme stresinden belirgin bir şekilde etkilendiğini, bu iskelelerdeki insan miofibroblastları tarafından matris birikimini ve organizasyonunu etkilediğini, hem parakrin sinyalizasyon hem de doğrudan temas yoluyla^19,43^,44. Özellikle, bu çalışmalar, kesme stresi ve esnemenin kombine uygulanması durumunda, doku oluşumu ve iltihabı üzerindeki etkilerin ya iki yüklerden birinin hakim olduğunu ya da her iki yükün sinerjik etkilerinin olduğunu ortaya koydu. Bu bulgular, mekanik ortamın TE proseslerine olan katkısını daha iyi anlamak için her iki yükün ayrıştırmasının alaka düzeyini göstermektedir. Bu anlayış, ilgili hemodinamik yükleme rejimlerinde iskele tasarım parametrelerini sistematik olarak optimize etmek için uygulanabilir. Buna ek olarak, bu tür iyi kontrol edilen ortamlardan elde edilen mekanistik veriler, yakın zamanda TEVG 65 veya TEHV⁶⁶ için bildirildiği gibi, yerinde doku tadilatının seyrini tahmin etmek için geliştirilen sayısal modeller için girdi görevi görebilirsiniz.

Protocol

Bu protokolde açıklanan çalışmalarda periferik kan buffy coats'dan izole edilmiş primer insan makrofajları ve koroner by-pass ameliyatından sonra saphenous damardan izole edilmiş insan miyofibroblastları^{kullanılmıştır 44}. Buffy paltolar, Sanquin Araştırma Kurumsal Tıbbi Etik Komitesi tarafından onaylanan yazılı bilgilendirilmiş onay sağlayan sağlıklı, anonimleştirilmiş gönüllülerden elde edildi. İnsan vena saphena hücrelerinin (HCSC) kullanımı, Hollanda'daki Tıp Toplulukları Federasyonu (FMWV) tarafından geliştirilen "İnsan Dokusunun Kod Uygun İkincil Kullanımına" uygundu.

1. Biyoreaktör Kurmadan Önce Genel Hazırlıklar ve Gerekli Eylemler

NOT: İlgili izolasyon ve kült protokoller hakkında ayrıntılı bilgi için lütfen önceki çalışma^19,43^,44'e bakın. Protokoldeki tüm hesaplamalar, 8 hemodinamik yüklü iskele ve 2 statik kontrolde tohumlanmış monositler ve miofibroblastlarla ortak kültür deneyi için örnek olarak verilmiştir (n=10).

1. Hücre yalıtımı ve hücre kültürünü başlatın. Monositlerin ve miyofibroblastların ortak kültürlü örnekleri için tohumlama yoğunlukları (tohumlama oranı 2:1 olan) sırasıyla 30 ×^{10 6} monosit/cm³ ve 15 × 10⁶ miyofibroblast/cm^3'tür.
   NOT: Elektrospun malzemesi yüksek gözenekliliğe sahiptir (%>90). Greft başına gerekli hücre sayısını tahmin etmek için, iskelenin hacmi içi boş bir silindirin hacmi formülü ile hesaplanır: π*(kalınlık)²* uzunluk ≈ 0.04 cm³. Greft başına toplam hücre miktarı 1.2 × 10⁶ monosit ve 0.6 × 10⁶ miyofibroblasttır. 10 örnek için en az 12 × 10⁶ monosit ve 6 × 10⁶ miyofibroblast gereklidir; olası pipetleme hatalarını hesaba katmak için ~%10-15'e kadar daha fazla hücre ile başlayın.
2. Biyoreaktör ile ilgili deneyler için kullanılacak hücre kültürü ortamını degas.
   1. Ortamı% 10 fetal sığır serumu,% 1 penisilin-streptomisinin ve% 0.5 L-glutamin ile desteklenmiş RPMI-1640:aDMEM (1:1) oluşan ortak kültürler için hazırlayın.
   2. Ortamı geceleme (O/N) bir hücre kültürü şişesine filtre kapağı ile gazdan arındırıcıya yerleştirin.
   3. Filtre kapağını hava geçirmez bir kapakla değiştirin ve 4 °C'de saklayın.
   4. Kullanmadan hemen önce, ortama 0,25 mg/mL L-askorbik asit 2-fosfat (C vitamini) ekleyin.
      NOT: Hesaplamalar için akış kültürü odası başına gereken ortam miktarı 50 mL'dir. Ortamı haftada üç kez yenileyin; 25 mL eski ortam, 25 mL taze ortam ile değiştirilir. 10 örnek için; tohumlamadan sonra, toplam 500 mL taze ortam gereklidir ve sonraki her orta değişiklik için toplam 250 mL taze ortam kullanılır. Her zaman orta taze hazırlayın, özellikle ortamı değiştirmeden hemen önce C vitamini eklenmelidir.
3. Van Haaften ve ark. 19 (Şekil 1G–I)tarafından açıklandığı gibi izotropik elektrospun iskeleleri⁽³ mm parlak çap, 200 μm duvar kalınlığı)hazırlayın. Kısacası, tübüler polikrolektoz bisurea (PCL-BU) iskeleler% 15 (w/ w) kloroform-polimer çözeltilerinden elektrospinning ile üretilir. Polimer çözeltileri oda sıcaklığında elektrospun ve %30 bağıl nemde, 40 μL/dk debide, dönen silindirik hedefe (Ø 3 mm, 500 rpm) 16 cm mesafede ve elektrospinning nozülde 16 kV ve hedefte -1 kV uygulamalı voltajdır.
   NOT: Bu deneyler için PCL-BU greftleri kullanılsa da, bu biyoreaktöre çok çeşitli elastomerik doku mühendisliği greftler monte edilebilir (örneğin, farklı sentetik veya doğal kökenli, farklı mikro mimarisi, farklı gözeneklilikler)
   1. Elektrospun iskelelerini mandrelden çıkarın.
      1. Mandrel'i merkezde 'tutmak' ve tüpün duvarına dokunmasını önlemek için 15 mL'lik bir tüpün kapağında küçük bir delik açın.
      2. Mandrel'i elektrospun iskelesi ile şahin tüpüne yerleştirin ve deiyonize suyla doldurun.
      3. Tüpleri -20 °C'de dondurun.
      4. Tüpleri oda sıcaklığına (RT) yerleştirin ve birkaç dakika sonra mandrelleri dışarı çekin, elektrospun greftlerini buzda bırakın.
      5. Buzun tamamen çözülmesine izin verin, elektrospun tüpünü çözülmüş sudan çıkarın ve birkaç saat boyunca dikey olarak kurumaya 'asın'. İskelelerin kendi ağırlıkları altında 'çökmemesine' dikkat edin.
   2. Vakumlu ameliyathane altında kuru iskeleler.
   3. Mikroyapılarını (örneğin, fiber morfolojisi, lif çapı) değerlendirmek için taramalı elektron mikroskopisi (SEM) kullanarak elektrospun greftlerinin küçük bir örneğini görüntüleyin. Örnek çalışmalardaki greftler izotropik lif yönelimine ve 5 μm lif çapına sahiptir(Şekil 1H–I).
4. Deneye başlamadan bir gün önce, deiyonize su ile dolu hidrolik rezervuarı inkübatöre yerleştirin. Akış kültürü odaları için sekiz bağlantının tümlerini beyaz Luer kapaklarıyla kapatın. Basınçlı hava sistemine bağlanın ve basınç sensörini takın. Teflon körüklerinin küçük bir genişlemesine izin vermek için gerinim pompasını çalıştırın (bkz. adım 5.6) O/N.
   NOT: Gerekli tüm malzeme ve ekipmanlarıntemizlendiğini ve/veya otomatik olarak kapatıldığını unutmayın (bkz. Malzeme Tablosu , Yorumlar/Açıklama sütununa bakın), malzemelerin otomatik olarak kapatılmasına izin verilir), üreticinin protokolüne göre veya 7.3–7.6 adımlarında açıklandığı gibi.
5. Protokolün geri kalanı için steril çalışma koşullarından emin olun.
   1. Steril bir laminar akış kabininde 2-5.3 (sistemi kurma), adım 6.3 (orta değişiklik) ve 7.1-7.2 adımlarını (vasküler yapıların hasadı) gerçekleştirin.
   2. Her şeyi mümkün olduğunca temiz tutmak için sonraki adımlar için doğrudan gerekli olmayan malzemeleri kapalı Petri kaplarına yerleştirin.
   3. %70 etanol içeren bir kağıt mendili ıslatarak malzeme yüzeylerini düzenli olarak temizleyin veya kurulayın ve biyoreaktör bileşenlerinin ve laminar akış kabininin yüzeylerini silin.

2. Biyoreaktörün Kurulması

NOT: Laminer akış kabininde 2.

1. Elektrospun iskelelerini yaklaşık 25 mm uzunluğunda tüpler halinde kesin ve kullanmadan önce belgeleyin (örneğin, uzunluk için fotoğraf, ilk kütle için terazi ile tartın).
2. Elektrospun iskelelerini arındırın.
   1. Elektrospun iskelelerini, UV ışığının (253,7 nm) iskelelerin içini aydınlatmasını sağlamak için ultraviyole (UV) ışık kaynağına bakan bir açıklıkla bir kuyu plakasına veya Petri kabına yerleştirin.
   2. Elektrospun iskelelerini 5 dakika boyunca UV ışığına maruz bırak.
   3. Tüm iskeleleri çevirin ve diğer açıklık için UV aydınlatmasını tekrarlayın.
      NOT: Bu adımdan sonra, elektrospun iskeleye sadece gerektiğinde dokunun. Her zaman temiz cımbız veya temiz eldiven kullanın.
   4. % 70 oranında depolanan akış kültürü odalarının cam tüplerini alın, cam tüpleri ultra saf suda yıkayın, kurutun ve büyük, kapalı bir Petri kabına yerleştirin.
      NOT: Aşağıdaki adımlar, özellikle 2.3–2.5 adımları, iki deneyci tarafından ideal olarak gerçekleştirilir.
3. Elektrospun iskelelerini silikon boruya monte edin.
   1. 5-0 prolene sütürünü silikon borunun bir ucuna takın, dikişi tüpün bir tarafından geçirip diğerinden çıkararak, borunun kesitini kapsayan iki zıt gergin dikiş bırakın. Tüpü düğümlerin çekirgesinde sıkıştırırken tüpün her iki tarafına küçük bir düğüm yapın ve her iki düğümde de yaklaşık 10 cm tel bırakın. İki 10 cm sol telin sonunda üçüncü bir düğüm yapın.
      1. Dikiş iğnesini ve dışarı çıkıp elektrospun iskelesinin içine zarar verebilecek tüm serbest iplikleri kesin. Silikon borunun kenarlarını üçgen şeklinde keserek silikon borunun elektrospun iskeleden çekilmesine yardımcı olur.
   2. Elektrospun iskelesini% 30 etanol içine batırın (bu ekstra dekontaminasyon adımı görevi görür ve elektrospun iskelesini silikon borunun üzerine kaydırarak yardımcı olur) ve elektrospun iskelesini serbest 10 cm telin üzerine yerleştirin. Experimenter A, hem silikon boruyu hem de 10 cm'lik dikiş telinin düğümünü hafifçe çekerek silikon boruyu uzatırken, deneyci B, elektrospun iskelesini, iskelelerin zarar vermesini önlemek için pürüzsüz bir iç uçlu cımbız kullanarak silikon borunun üzerine hafifçe kaydırır.
   3. Elektrospun iskelesini cımbızla aynı anda pürüzsüzleştirirken silikon boru üzerindeki streçleri yavaşça serbest bırakın. Elektrospun iskelesini silikon boruya iki kez ultra saf suya batırın.
      NOT: Elektrospun iskelesinin bir miktar buruşukluğu meydana gelebilir. Bu buruşma, 2.5.3 adımında iskeleleri basınç kanallarına sabitlemeden hemen önce uygulanan ön streç sırasında kaybolacaktır.
   4. Diğer elektrospun iskeleleri için 2.3.2 ve 2.3.3 adımlarını yineleyin. Silikon borunun uzunluğuna bağlı olarak, aynı silikon boruya birden fazla elektrospun iskelesi monte edilebilir.
   5. Tüm elektrospun iskeleleri silikon boruya monte edildiğinde, silikon boruyu iskelelerin etrafına, hepsi aynı uzunluğa (5,5 cm) kesin; bir tarafta, elektrospun iskelesinin ucuna yakın, diğer tarafta ~ 2-3 cm serbest silikon boru bırakarak.
4. Akış kültürü odasının alt bölmesini inşa edin(Şekil 1A–B).
   1. Akış çıkışını içeren alt bölmenin üst kısmını alın ve akış çıkışını erkek bir Luer fişi ile kapatın.
   2. Basınç kanalını delikli olarak alt bölmeden geçirin ve sızıntıyı önlemek için basınç kanalının alt ucuna silikon bir O-halka yerleştirin. Basınç kanalını sabitlemek için alt bölmenin alt kısmını alt bölmenin üst kısmına vidaleyin. Basınç kanalının alt oyma oluğunun, alt bölmenin adaptör burçlarının kenarından yaklaşık 3-5 mm yukarıda olduğundan emin olun; bu daha sonra dikiş telinin sıkı düğümünü 'tutacak', elektrospun iskelesini silikon borunun üzerine sabitleyecektir.
      NOT: Basınç kanalı kolayca yukarı ve aşağı manevra yapılabiliyorsa, alt bölmenin iyi sabitlenmemiş olduğunu gösterir. Daha sonraki aşamalarda sızıntıyı önlemek için 2.4.2 adımlarını yineleyin (Şekil 2D).
5. Silikon boruyu elektrospun iskelesi ile basınç kanalına sabitleyin.
   1. Silikon tüpü elektrospun iskelesi ile basınç kanalının üzerine çekin.
   2. Basınç kanalı üzerindeki oyma oluğun bulunduğu yerde elektrospun iskelesinin alt ucundaki dikiş teli ile bir düğüm yapın. Silikon boruyu elektrospun grefti ile sıkıca sabitlemek için karşı tarafta ikinci bir düğüm yapın.
      DİkKAT: Bu kritik bir adımdır. Suyun hidrolik rezervuardan akış kültürü odalarına sızmasını önlemek için düğümün basınç kanalının oyulmuş oluğuna tam olarak 'düştüğünden' emin olun. Emin değilseniz, son düğümlerin tam olarak oyma oluğunda olduğundan emin olmak için dikiş telini oluğun beklenen yerinin üstünde veya altında birkaç pozisyonda sıkmaya çalışın (Şekil 2A).
   3. Makas kelepçesini silikon tüpün üst ucuna yerleştirin ve silikon boruyu yukarı doğru uzatın (bu doğrudan ilk düğümü test edecektir, eğer elektrospun iskelesi ile silikon boruyu basınç kanalının üzerine taşımak mümkünse, yeterince iyi sıkılaşmamıştır). Çekme kuvveti ile silikon boru önceden gerilir. Silikon borunun farklı numuneler arasında tutarlı olduğundan emin olmak için makas kelepçesine bir cetvel takın. Cetvelin alt ucu iskelenin alt ucunun yüksekliğine ulaşana kadar makas kelepçesini yukarı doğru çekin.
      NOT: Her numunedeki ön streç yaklaşık olarak aynı (~%5) iki nedenden dolayı önemlidir: (1) silikon boru önceden gerilmişse, basınçlandırıldığında numunenin uzunluğu boyunca daha homojen genişlemeye neden olur; (2) ön streç silikonun mekanik özelliklerini etkileyecektir, bu nedenle numuneler arasında eşit esneme koşulları sağlamak için tüm numunelerde aynı olmalıdır.
   4. Elektrospun iskelesini hafifçe çekerek elektrospun iskeleslerindeki kırışıklıkları giderin. Yine, basınç kanalı üzerindeki üst oyma oluğun bulunduğu yerde iskelenin üst ucunda bir dikiş teli ile her iki taraftan iki düğüm yapın.
   5. Makas kelepçesini bırakın ve burun konisi vida ipliğine monte edildiğinde sızıntıyı önlemek için silikon borunun fazlalığını bir bıçakla kesin ve vida ipliğinin% 20-30'unu silikon boru ile kaplı bırakın.
      NOT: Tüm dinamik örnekler için 2.4 ve 2.5 adımlarını yineleyin.
   6. Statik kontrol numuneleri için silikon boruya monte edilen elektrospun iskelesini deliksiz basınç kanallarında sabitleyin. Bu kanallar tohumlanana kadar 15 mL'lik bir tüpte ayrı ayrı tutulabilir (adım 4) ve akış kültürü odası bölmelerine monte edilmesi gerekmez.
6. Kısmen inşa edilmiş akış kültürü odalarını 10 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakarak elektrospun iskelesi ile arındırın. Elektrospun iskeleli akış kültürü odalarını diğer tarafa çevirin ve UV ışığına maruz kalmayı 10 dakika boyunca tekrarlayın.
7. Burun konilerini, dinamik numuneler için delikli basınç kanallarının vida ipliğine vidaleyin.
   1. Silikon borunun üst ucunun burun konisine sığmasını sağlayarak daha sonraki aşamalarda sızıntıyı önleyin. Çok fazla silikon boru varsa, boru fazlalığını bir bıçakla kesin.
   2. Kısmen inşa edilmiş akış kültürü odalarını büyük bir Petri kabına yerleştirin ve burun konisini UV ışık kaynağına doğru yönlendirin. 5 dakika boyunca UV aydınlatma uygulayın.
8. Akış kültürü odasının cam tüpü ve akış kültürü odasının üst bölmesi ile akış kültürü odasının komple inşası (Şekil 1A–B).
   1. Basınç kanalını silikon boru ve elektrospun iskelesi ile % 30 etanol içine batırarak elektrospun iskelelerini önceden ıslatın, ardından iki kez ultra saf suya daldırın.
   2. Cam tüpü basınç kanalının üzerine yerleştirin ve alt bölmeye hafifçe itin ve hafifçe sabitleyin.
   3. Akış girişini içeren üst bölmeyi alın, silikon bir O-halkası, akış düzleştiricisi ve adaptör burçlarını doğru sırayla (Şekil 1A–B)yerleştirin ve cam tüpün açık ucuna yerleştirin ve hafifçe sabitleyin.
   4. Üst bölmenin akış girişine beyaz bir Luer kapağı vidala.
   5. Erkek Luer fişini alt bölmenin akış çıkışından çıkarın ve etrafındaki yüzeyi etanolle ıslatılmış bir kağıt mendille temizleyin.
   6. Akış çıkışına 10 mL ultra saf su ile bir şırınna yerleştirin, üst bölmedeki beyaz Luer kapağını açın ve odayı ultra saf suyla doldurun. Beyaz Luer kapağını tekrar kapatın, şırınnayı çıkarın, etanol ile tekrar temizleyin ve akış çıkışını erkek bir Luer fişi ile kapatın.
      NOT: Tüm akış kültürü odaları için 2.6–2.8 adımlarını yineleyin.
   7. Statik kontroller için, basınç kanallarına monte edilen numuneleri deliksiz tutan 15 mL'lik tüplere 10 mL ultra saf su ekleyin.
9. Tüm akış kültürü odalarını inkübatöre yerleştirin. Hücre tohumlamadan bir gün önce ultra saf suyu, 2.8.5 ve 2.8.6 adımlarında açıklandığı gibi kültür ortamıyla değiştirin ('eski' ultra saf suyu doğrudan akış çıkışına yerleştirilmiş etanol kaplı bir kağıt mendille topladığından emin olun).

[Protokol burada duraklatılabilir]

3. Akış pompası kurulumu için hazırlıklar

NOT: Laminer akış kabininde 3.

1. Tüm pompa kurulum malzemelerini toplayın ve kullanıma hazırlanın.
   NOT: Deneyciler, pompayı, akışkan üniteleri ve orta boruyu akışkan ünitenin valflerinden kurmanın ayrıntılı bir açıklaması için üreticinin protokolüne başvurulur.
   1. Pompayı 200 mbar kapasiteye ayarlayın.
   2. Rezervuar tutucularını 60 mL rezervuarlar için akışkan ünitelere vidala.
   3. Yeniden kullanılabilir kauçuk hava filtrelerini etanol içine batırılmış bir kağıt mendille temizleyin, hava filtresinin kuru kaldığından emin olun.
2. 60 mL rezervuarları rezervuar tutucularına yerleştirin ve standart orta boruyu akışkan ünitenin valflerinden yerleştirin. Orta boruyu dişi Luer kilit bağlayıcıları ile daha büyük bir iç çapa bağlayın.
3. Orta boruyu rezervuarların hemen altında bir hortum klipsi ile sıkıştırın.
4. Rezervuarları 60 mL rezervuar başına 25 mL kültür ortamı ile doldurun. Hortum klipsini bırakın ve ortamın boruya girmesine izin verin.
5. Orta rezervuarları kauçuk hava filtreleriyle kapatın ve akış pompası kurulumunu 4.

4. Fibrin'i Hücre Taşıyıcısı Olarak Kullanan Hücre Tohumlama

NOT: Laminer akış kabininde 4.

1. Hücre tohumlama adımı için fibrin jelini hazırlayın. Ayrıntılar için bkz. Mol ve ark.⁶⁷ Fibrin jeli için fibrinojen çözeltisi 10 mg/mL'lik son konsantrasyona sahip olmalıdır (protein stoğunun saflığı için doğru) ve trombin çözeltisi 10 U/mL'lik son konsantrasyona sahip olmalıdır.
   1. Kırmızı kapaklı plastik bir kapta ~50 mg (10 numune için yeterli) tartmadan önce fibrinojeni RT'ye çözün.
   2. Fibrinojen çözeltisini hazırlamak için hücre kültürü ortamı ekleyin (protein stoğunun saflığı için doğru olan 10 mg / mL konsantrasyonda). İyice karıştırın ve fibrinojen çözeltisini 0,2 μm şırıng filtresi ile sterilize etmek için steril 15 mL tüpe filtreleyin. Filtrelenmiş fibrinojen çözeltisini buzda tutun.
      NOT: Fibrinojen çözeltisini çok önceden hazırlamaktan kaçının, aksi takdirde fibrinojen kendiliğinden pıhtılaşabilir.
   3. Trombini çözün ve hücre kültürü ortamında ve buzun üzerine yerleştirin bir trombin çözeltisi (10 U/mL konsantrasyonunda) yapın. Numune başına 20 μL trombin + hücre çözeltisi hazırlayın. n=10 numuneler için 200 μL gereklidir; bu nedenle, olası pipetleme hatalarını hesaba katmak için 250 μL trombin çözeltisi hazırlayın.
2. Kültür şişelerindeki hücreleri toplayın ve sayın. Hücreleri istenen oran ve miktarda karıştırın (1,2 × 10⁶ monosit ve 0,6 × iskele başına^{10 6} miyofibroblast). Pipetleme hatalarını düzeltmek için n+1 örnekleri için yeterli hücre olduğundan emin olun. RT'de 10 dakika boyunca 350 × g'da santrifüj.
3. Askıya alınan hücrelerin ve trombinin bir karışımını yapın.
   1. Her numune için 20 μL trombin çözeltisi kullanın. n=10 numuneler için hücre peletine 200 μL trombin ekleyin ve karıştırın. Hücre süspansiyonunun (hücreler + trombin) hacmini ölçün ve 10 iskelenin tümüne eşit olarak nasıl bölüneceğini hesaplayın (örneğin, trombin + hücre süspansiyonu 260 μL hacme sahipse, her elektrospun örneği 260 μL / 10 örnek = 26 μL trombin + hücre süspansiyonu alacaktır).
   2. İskelelerin tohumlanması iki adımda gerçekleştirilirken, her iskele için hücre süspansiyonunun yarısını tutacak iki adet 1,5 mL mikrobuge tüpü hazırlayın (önceki adımın örnek hesaplamasında: 13 μL trombin + hücre süspansiyonu ile iki tüp hazırlayın). Buzun üzerine koy.
      NOT: Aşağıdaki adımlar, özellikle adım 4.4, ideal olarak iki deneyci tarafından gerçekleştirilir.
4. Hücre tohumlamaya hazırlanmak için önceden ıslatılmış elektrospun iskelelerini vakumla kurulayın.
   1. Laminar akış kabininin vakum sistemine bir cam Pasteur pipet bağlayın ve steril geçici depolama için boş bir 50 mL tüpe yerleştirin.
   2. Akış kültürü odalarını inkübatörden alın, erkek Luer fişini akış çıkışından çıkarın ve beyaz Luer kapağını açtıktan ve akış çıkışının önüne etanol batırılmış bir kağıt mendil yerleştirdikten sonra ortamı çıkarın.
   3. Üst bölmeyi ve cam tüpü çıkar ve geçici depolama için steril bir Petri kabına yerleştirin.
   4. Vakum Pasteur pipetini elektrospun iskelesine yerleştirin ve mümkün olduğunca fazla ortam çıkarın.
      DİkKAT: Elektrospun iskelesini çok nazikçe vakumlayın. İskele üzerinde ileri geri doğrusal bir hareket yerine, vakum pipetini birden fazla yere yerleştirin. Daha iyi kontrol için pasteur pipetinin üstündeki vakum borusunu parmakların arasına sıkıştırın.
   5. Fibrinojen çözeltisini trombin + hücre süspansiyonu ile 1:1 oranında karıştırın (örneğin, 13 μL fibrinojeni 13 μL trombin + hücre süspansiyonu ile karıştırın). Fibrin polimerize olduğundan emin olmak için mikrofuge tüpünde değil, iskelede boru, fibrinojen boru, trombin + hücre süspansiyonunun 'ekstra hacmi' için pipet tekerleğini çevirin ve karıştırmak için hücre süspansiyonu ile mikrop tüpünde bir kez yukarı ve aşağı borulayın.
   6. Çözeltiyi elektrospun iskelesinin tam uzunluğu boyunca doğrudan homojen bir şekilde damlatın. Experimenter A'nın fibrin karışımını damlatması, deneyci B'nin ise alt bölmeyi basınç kanalına monte edilmiş elektrospun iskelesi ile tutması önerilir.
   7. Hücrelerle birlikte fibrin elektrospun iskelesinin üzerine damlatıldıktan sonra, Deneyci B, hücreleri iskele üzerinde eşit olarak bölmek için iskeleyi yavaşça soldan sağa ve yukarı ve aşağı hareket ettirer.
   8. Elektrospun iskelesinin diğer tarafındaki 4.4.5 - 4.4.7 adımını yineleyin.
   9. Cam tüpü dikkatlice yerleştirerek akış kültürü odasını tekrar monte edin (cam tüpün iç tarafına fibrin yapışmasını ve pıhtılaşmasını önleyin) ve akış kültürü odasının üst bölmesini geri itin. Tohumlu yapıyı, herhangi bir orta veya fosfat tamponlu salin (PBS) olmadan doğrudan inkübatördeki akış kültürü odasına yerleştirin.
   10. Tüm dinamik örnekler için 4.4.1–4.4.9 adımlarını yineleyin. Deliksiz basınç kanallarına monte edilen statik numuneler için, 4.4.1–4.4.8 adımlarına göre tohumlayın ve daha sonra 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
   11. Fibrin inkübatörde 60 dakika polimerize olsun.

[Protokol burada 30-60 dakika duraklatılabilir.]

5. Polimerizasyondan sonra, akış kültürü odalarını (dinamik numuneler) veya 15 mL tüpleri (statik numuneler) orta ile doldurun.

5. Deneye başlamadan önce biyoreaktör ve akış pompası sistemlerinin bağlantısı

NOT: Laminer akış kabininde 5.1–5.3 adımlarını uygulayın.

1. Akış kültürü odalarını ve akışkan üniteleri taşıyan tepsiyi, laminar akış kabinlerinin içine doldurulmuş orta rezervuarlar ve bağlı orta borularla alın.
2. Akış kültürü odalarını döngüsel streç ve kombine hemodinamik yüklerle dolu deney grupları için biyoreaktör tabanına yerleştirin (Şekil 1E).
   1. Akış kültürü odasını baş aşağı eğin ve basınç kanalını ince borulu bir şırınga kullanarak ultra saf suyla doldurun (bu, esnek ve ince olduğu sürece her türlü olabilir, bu deneyde iğneye 10 cm uzunluğunda, 0,15 mm iç çaplı bir tel tutturuldu).
   2. İnce boruyu basınç kanalının içine yerleştirin ve basınç kanalı, suyu şırınnadan kademeli olarak iterek ultra saf suyla doldurulurken, basınç kanalının içinde hava kabarcıkları olmadığından emin olmak için teli basınç kanalının içinden aynı anda çekin.
   3. Akış kültürü haznesini biyoreaktör tabanındaki sekiz vida ipliğinden birine yerleştirin. Olası sızıntıyı önlemek için biyoreaktör tabanı ile beyaz Luer konektörü arasına silikon bir O-halka yerleştirin ve beyaz Luer konektörünü alt bölmeden sıkın.
   4. Döngüsel olarak gerilmiş tüm numuneler için 5.2.2 ve 5.2.3 adımlarını yineleyin.
3. Statik kontrol hariç tüm deney grupları için akış kültürü odalarını akış pompası sistemine bağlayın.
   1. Orta boruya bir hortum klipsi yerleştirin. Akış kültürü odasının üst bölmesinin akış girişini kaplayan beyaz Luer kapağını çıkarın. Orta borunun dişi Luer bağlayıcısını çıkarın ve bir taraftaki orta boruyu üst bölmedeki akış girişiyle, orta borunun diğer tarafını ise alt bölmedeki akış çıkışıyla bağlayın.
   2. Tüm akış kültürü odaları için 5.3.1 adımlarını yineleyin. Bu noktada biyoreaktör ve akış kültürü odaları orta ile doldurularak akış sistemlerine bağlanmaktadır.
   3. Statik kontrol numuneleri için, makas kelepçesini kullanarak numuneleri filtre kapaklı bir hücre kültürü şişesine dikey olarak yerleştirin. Hücre kültürü şişesini orta ile doldurun ve inkübatöre yerleştirin.
4. Tüm kurulumu laminer akış kabininden inkübatöre aktarın ve akışkan üniteleri hava basıncı tüpüne ve elektrik kablosuna bağlayın.
5. Yazılımı başlatın ve akış pompalarını başlatın. Numuneler için orta akışı tek tek başlatın.
   1. Akışkan ünitenin vanalarının tıkırdayıp tıklama olmadığını kontrol edin.
   2. Hortum kelepçesini orta borudan çıkarın.
   3. Akış pompasını 100 mbar ve 10 s anahtarlama süresi ile başlatın.
   4. Olası sızıntı veya hava kabarcıkları için akış yönünü dikkatlice kontrol edin. Herhangi bir tuzaklı hava kabarcıkları, akış kültürü odasını ters çevirerek çıkarılabilir.
      NOT: Akış kültürü odalarındaki sisteme ve hava kabarcıklarına hava emilmesini önlemek ve rezervuarların kuru çalışmasına izin vermemek için orta rezervuarlardaki orta seviyelerin dengeli olduğundan emin olun (Şekil 2C).
   5. Tüm akışkan üniteler için 5.5.
6. Gerinim pompasını başlatın.
   1. Pnömatik aktüer pompayı pnömatik silindir üzerindeki hava girişi aracılığıyla basınçlı havaya bağlayın. Alt hava çıkışını hava çıkışı için mavi boruya bağlayın (Şekil 1F).
   2. LabVIEW yazılımını açın, Van Kelle ve ark.⁶⁸tarafından açıklandığı gibi LabVIEW komut dosyasını ve basınçlı hava basıncı uygulama sistemini çalıştırın, yer değiştirme ve frekans girin (0,2 Hz'lik düşük frekansla başlayın). Teflon körük en düşük seviyedeyken pompayı duraklatın.
   3. Basınç sensörini hidrolik hazne üzerindeki basınç sensörü girişine yerleştirin.
7. Pompa ayarlarını istediğiniz ayarlara değiştirin (1,5 Pa için 150 mbar, 10 s anahtarlama süresi kullanın).
8. Gerinim pompasını çalıştırın ve tercih edilen ayarı uygulayın (örneğin, 0,5 Hz, 1,05 streç).

6. Deneyi Birden Fazla Gün Boyunca Çalıştırmak; Kültür ve Orta Değişim Sırasında Makas ve Esnemenin İzlenmesi

1. İskele duvarındaki WSS'i hesaplayın.
   1. Akış büyüklüğünü her gün kaydedin (ayrıntılar için akış pompası üreticisinin el kitabına bakın). Kısacası, 10 sn boyunca akışkan birim rezervuarının geçişi arasındaki orta rezervuarlardaki sıvı seviyelerindeki (mL olarak) değişimi gözlemleyin. ML/dak'ta Q akış hızını elde etmek için en az beş ölçüm gerçekleştirin, ortalama değeri hesaplayın ve 6 ile çarpın.
   2. Akış, bir açıksal kanaldan geçen bir Poiseuille akışı ile tanımlanır. Kültür ortamını Newton sıvısı olarak varsayarsak, iskele duvarındaki WSS'yi hesaplayın, r₁, Denklem 1 ile.
      (1)
      burada WSS iskele_duvarında ( r₁; burada r1 =_1.7 mm), sabit bir durum akışından kaynaklanan, uygulanan basınç p ve cam tüpün iç yarıçapı r2 (burada r₂ = 2.3 mm) ile belirlenir. Eksenel yöndeki basınç gradyanı, akış girişi ve akış çıkışı arasında tekdüze olduğu varsayılır ve Denklem 2 (Şekil 1J)ile verilir.
      (2)
      dinamik viskozite μ (burada orta viskozite sabit kabul edildi, μ = 0.7 × 37 °C'de 10^-3 Pa¹ s) ve Q uygulanan akış hızı.
2. İskelelere her gün uygulanan esnemeyi izleyin.
   1. İskele ile arka plan arasındaki kontrastı artırmak için akış kültürü odasının arkasına koyu bir arka plan yerleştirin. İskelenin görselleştirilmesine yardımcı olmak için LED ışık lambalarını iskeleye doğru konumlandırın.
   2. Yüksek hızlı kamera ile 6 s (yani 3 streç döngüsü) için 30 Hz frekansta iskelenin hızlandırılmış fotoğraflarını çekin.
      NOT: Kamera izin verirse daha düşük bir kayıt frekansı yeterli olabilir. Ancak, minimum gerekli frekans belirlenmedi.
   3. Görüntülerden iskelenin minimum ve maksimum çapını manuel olarak belirleyin.
   4. Denklem 3'e göre maksimum esnemeyi hesaplamak için elektrospun iskelesinin minimum ve maksimum dış çapını hesaplayın.
      (3)
      burada çevresel streç (φ_φ) iskelenin dış çapı, d₁ve başlangıç çapı, d₀arasındaki oran ile verilir.
3. Orta buharlaşma için doğru ve haftada üç kez orta yenileme.
   1. Akış sistemleri ve gerinim pompası için kabloları durdurun ve ayırın.
   2. Hortum klipslerini orta boruya yerleştirin.
   3. Orta rezervuarlardaki hacim göstergesi işaretlerine göre ne kadar ortamın buharlaştığını belirleyin.
   4. Tepsiyi biyoreaktör ve akışkan ünitelerle laminer akış kabinine aktarın.
   5. Orta rezervuarların kauçuk hava filtrelerini çıkarın; buharlaştırılmış ortam hacmini telafi etmek için otomatik kapatılmış ultra saf su ekleyin. Orta rezervuarları tekrar kapatın ve ortamı ultra saf suyla karıştırmak için pompaya tekrar bağlayın.
   6. 6.3.1–6.3.5 adımlarını yineleyin. Kauçuk hava filtrelerini tekrar çıkarın, 25 mL kültür ortamını çıkarın ve RT'de 5 dakika boyunca 300 × g'da aşağı doğru döndürün.
      1. 1,5 mL süpernatant toplayın ve salgı profillerinin analizi için -30 °C'de saklayın (enzime bağlı immünosorbent test (ELISA) ile analiz için).
      2. Süpernatantı şartlandırılmış orta⁴³olarak kullanarak, parakrin sinyal çalışmaları için istenen süpernatant hacmini toplayın.
   7. Orta rezervuarlara 25 mL taze orta ekleyin.
   8. Kauçuk hava filtrelerini orta rezervuarlara geri yerleştirin.
   9. Kurulumun tamamını inkübatöre geri yerleştirin; tüm kabloları ve hava tüplerini pompaya ve gerinim pompasına bağlayın. Hortum klipslerini bırakın ve 5.4–5.8 adımlarını tekrarlayın.
4. Pompaya bağlı kurutma şişelerindeki silika kurutma boncuklarının nemli olup olmadığını kontrol edin (beyaz görünüm) ve gerekirse kuru silika boncuklarla değiştirin (turuncu görünüm).

7. Deney, Numune Toplama ve Ekipman Temizleme ve Depolamayı Sonlandırma

1. Deneyin son gününde, 6.3.1–6.3.5 adımlarında açıklandığı gibi orta buharlaşma için doğru ve numuneleri tek tek toplayın.
   1. Numuneleri tek tek toplamak için akış pompasının ve gerinim pompasının birkaç kez duraklatılması gerekir. Orta boruya bir hortum klipsi yerleştirin. Akış pompasını ve gerinim pompasını geçici olarak durdurun. Bir akış kültürü odasını biyoreaktör tabanından ayırın; biyoreaktör tabanında beyaz bir Luer kapağı ile değiştirin. Akış kültürü odasını ve akışkan üniteyi laminar akış kabinine alın. Hemodinamik yükü hasat olana kadar diğer numunelere uygulamak için akış pompasını ve gerinim pompasını tekrar çalıştırın.
   2. ELISA aracılığıyla parakrin sitokin üretim analizi için orta rezervuarlardan orta toplayın.
2. Akış ünitelerini ayır ve boru şeklindeki yapıyı hasat edin. İstenilen kesme şemasına göre bölüm. Yapının parçaları 4 °C'de (%3,7 formaldehitte 15 dk fiksasyon ve PBS'de 3 x 5 dk yıkamadan sonra) veya -30 °C'de (sıvı nitrojende çıtçıt dondurarak) bir sonraki analize kadar saklanabilir.
3. Biyoreaktör ve pompa bileşenlerini temizleyin. Ayrıca, madde başına tavsiye edilen temizleme yöntemi Malzeme Tablosunda belirtilmiştir.
   1. Kauçuk hava filtrelerini % 70 etanol ile temizleyin. İç filtreyi nemlendirmemeye çok dikkat edin!
   2. Tüm ayrı bileşenleri toplayın: orta borular, orta rezervuarlar, cam borular, erkek Luer fişleri ve dişi Luer kilitleri, beyaz Luer kapakları, basınç kanalları, burun konileri, silikon O-halkaları, adaptör burçları, akış düzleştiriciler (pompalar, akışkan üniteler, kauçuk hava filtreleri, biyoreaktör tabanı hariç) ve akan musluk suyunda durulayın.
   3. O/N'yi deiyonize suya% 0.1 sodyum dodecylsulfate yerleştirin.
      NOT: Parçalar paslanabileceğinden ultra saf su kullanmayın.
   4. Musluk suyu ve bulaşık sabunu ile durulayın.
   5. İyonize suya daldırın, ardından iki kez% 70 etanol, ardından deiyonize su.
   6. Tüm malzemeleri kağıt mendillere ayrı ayrı yerleştirin ve kurumasına izin verin. Boruları kurutmak için basınçlı hava kullanın.
   7. Otoklavlanamaz tüm malzemeleri% 70 etanol içine batırılmış bir kağıt mendille temizleyin. Bu, kauçuk hava filtresini (hava filtresinin kuru kalması gerektiğini unutmayın) ve biyoreaktör tabanını (Teflon körük ve pnömatik silindir) içerir.
   8. Akışkan odanın bileşenlerini (silikon O-ring dahil), orta boruyu, orta rezervuarları (kauçuk hava filtresi olmadan), erkek Luer fişlerini ve dişi Luer bağlayıcılarını, beyaz Luer kapaklarını, hortum klipslerini ve standart ekipmanı (örneğin, cımbız, sıkma makası) otoklavlayın
   9. Sonraki denemeler sırasında rahat kullanım için, bir tam akışkan oda için ayrı bileşenleri otomatik kapatılabilir bir kutuda birleştirin.
4. Suyu hidrolik rezervuardan çıkarın. % 70 etanol ile temizleyin, ardından deiyonize su. Bırakın kurusun. İyonize su ve birkaç damla su banyosu koruyucu dezenfektan ile doldurun.
5. Akış kültürü odası için cam tüpleri% 70 etanolde saklayın.
6. Nemli silika kurutma boncuklarını (beyaz görünüm) 120 °C'de fırınA yerleştirin ve kurumasını (turuncu görünüm) ve hava geçirmez bir şişede saklayın.

Representative Results

Bu biyoreaktör, 3D biyomalzeme iskelelerinde kesme stresi ve döngüsel esnemenin vasküler doku büyümesi ve yeniden şekillendirilmesi üzerindeki bireysel ve kombine etkilerini incelemek için geliştirilmiştir. Biyoreaktörün tasarımı, çeşitli yükleme koşullarında sekiz vasküler yapının kült örüldürülmesine izin verir (Şekil 1A). Vasküler yapılar, hem çevresel streç hem de WSS'nin bağımsız olarak kontrol edilebildiği bir akış kültürü odasına(Şekil 1B)yerleştirilmiştir. Akış kültürü odasının üst bölmesi, akışı nispeten kısa bir çökeltme uzunluğunda stabilize etmek için bir akış düzleştirici tutar(Şekil 1C). Akış düzleştiricinin doğrudan aşağı akışında, burun konisi akışı açısal kanaldan eşit olarak dağıtır (Şekil 1D). Protokolün tüm adımları doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, akış kültürü odasındaki vasküler iskeleler, iskele ile cam duvar arasındaki tek yönlü kanaldan sürekli tek yönlü akışa tabi tutulabilir ve pnömatik pompa tarafından çevresel olarak gerilir (Şekil 1E–F). İskele monte etmeden önce elektrospun tüpü 25 mm'lik tüplere (Şekil 1G)kesilmeli ve mikro mimarisi analiz etmek için SEM ile incelenebilir (Şekil 1H–I). Bu örnekteki PCL-BU greftlerinin, diğer elastomerik doku mühendisliği greftleri (doğal veya sentetik kökenli, farklı mikro mimarisi veya gözeneklilik) ile değiştirilebileceğini belirtmek önemlidir. İçten dışa tasarım, sızdırmaz olması gerekmediğinden, son derece gözenekli greftlerin test edilmesine izin verir. Akış kültürü odasının şematik görüntüsü, denklemlerde WSS (denklem 1), basınç gradyanı (denklem 2) ve çevresel esnemeyi (denklem 3) tanımlamak için kullanılan parametrelerin fiziksel yorumunu gösterir (Şekil 1J).

Protokolün kritik adımlarının yanlış yürütülmesi birkaç senaryoya neden olabilir. Örneğin, hidrolik rezervuardan sızıntı, yanlış monte edilmiş düğümlerin bir sonucu olarak ortaya çıkabilir ve silikon tüpü geçen ve akış kültürü odasına giren deliklerle basınç kanallarından hidrolik sıvının sızmasına yol açabilir (Şekil 2A). Vida iplikleri ile biyoreaktör tabanı arasındaki bağlantıda hidrolik sıvının sızması, silikon halka iyi yerlenmediğinde veya Teflon körüklüğe deneyden bir gün önce O/ N'yi hafifçe genişletmesine izin verilmediğinde de meydana gelebilir(Şekil 2B). Ayrıca, orta gazdan arındırılmadığında veya orta rezervuarlardaki orta seviyeler iyi dengelenmediğinde ve bir orta rezervuar kurursa, havanın sisteme emilmesine neden olursa, akış kültürü odasında hava kabarcıkları ortaya çıkabilir (Şekil 2C), bu da WSS patters'ı rahatsız eder, hücre canlılığını ve sonraki doku büyümesini tehlikeye atabilir. Son olarak, alt bölmedeki silikon O halkası doğru şekilde yerlendirilmediğinde, akış kültürü odasının altında orta dökülme gözlenebilir(Şekil 2D).

Bu biyoreaktör kurulumu bireysel ve kombine hemodinamik yüklerin uygulanmasına izin verdiğinden, birden fazla hemodinamik yüklü deney grubu bir deneye dahil edilebilir (Şekil 3A). Daha önce, farklı hemodinamik yükler (yani, iki kesme gerilme rejimi ve iki germe rejimi) çeşitli olası sistem ayarları uygulanarak doğrulanmıştır (Şekil 3B). Uzun süreli kültür dönemlerinde streç (Şekil 3C) ve WSS (Şekil 3D) izlendiğinde, bunların 20 güne kadar bir süre boyunca nispeten sabit seviyelerde tutulabileceği doğrulanmıştır.

Biyoreaktör, hemodinamik yüklemenin büyüme ve yeniden şekillendirme üzerindeki etkisini yerinde bir vasküler TE bağlamında incelemek için özellikle uygundur. In situ TE aşamaları, doğal yara iyileşme yanıtının aşamalarını yansıtmak için hipotez edilir (Şekil 4A). Burada açıklandığı gibi, insan saphenöz damarlarından elde edilen monosit türevli makrofajların ve miofibroblastların ortak kültürleri, proliferatif fazın in vitro bir taklitçisi olarak kurulmuştur. Tohumlamadan üç gün sonra, immünofluoresans lekeleme, her iki hücre tipinin iskele boyunca homojen bir dağılımını göstermiştir (Şekil 4B). 20 günlük ortak kültürden sonra, döngüsel streç tek başına daha çok sayıda ve daha kalın kollajen tipi I liflerinin birikmesiyle sonuçlanırken, kombine hemodinamik yüklere sahip grupta, döngüsel streç bu etkisi kesme stresi ile geçersiz kılındı ve burada immünoresans boyama ile gösterilen daha az belirgin kollajen tipi I birikimi ile sonuçlandı (Şekil 4C). Başarılı in situ doku yenilenmesi için doku üretimi ile iskele resorpsiyonu arasında sıkı bir denge gereklidir. Doku oluşumuna ek olarak, biyoreaktör hücre güdümlü iskele rezonansının indüksiyonunu sağlar. Örneğin, elektrospun greftleri üzerinde 8 gün boyunca makrofajların mono-kültürünün kültlenmesi sırasında, tüm hemodinamik yükleme rejimlerinde, statik grupta en belirgin resorpsiyon ve kesme stres grubunda en az belirgin resorpsiyon ile fiber erozyon ve lif bölünmesi gözlenmiştir (Şekil 4D). Bu sonuçlar birlikte, farklı hemodinamik yükleme rejimlerinin hem büyüme hem de yeniden şekillendirme üzerindeki etkisini göstermektedir. Bu içgörüler, yeni geliştirilen yerinde TEVG'ler için tasarım parametrelerini optimize etmede yardımcı olur.

Doku yenilenme sürecinin bir diğer önemli belirleyicisi pro-ve antienflamatuar sitokinlerin varlığıdır. Biyoreaktör kapalı döngülü bir sistem olduğundan, sistemdeki hücreler salgılanan faktörlerin parakrin uyaranlarına sürekli olarak maruz kalacaktır. İnsan periferik kan mononükleer hücresinin (PBMC) dinamik yüklü ortak kültürlerinin ortamındaki sitokin salgı profilleri ve saphenöz damarlardan elde edilen insan miyofibroblastları erken ve sonraki aşamalarda analiz edilmiştir(Şekil 5A). Bu temsili sonuçlar, hem döngüsel esneme hem de kesme stresinin ortak kültür kurulumundaki sitokin salgı profili üzerindeki etkisini göstermektedir. İlginçtir ki, her iki yükün birleşik etkileri, iki yükten birinin (örneğin, interlökin-6 (IL-6) ve monosit kemoattraktant protein-1 (MCP-1)) için döngüsel streç veya her iki yükün sinerjik etkilerini (örneğin IL-10 için) göstermiştir (Şekil 5B). Bu in vitro test platformu kullanılarak toplanan bu içgörüler, makrofaj odaklı in situ doku yenilenmesinin mantığına dayanan yerinde TEVG'lerin gelişimi için değerli bilgiler verir.

Makrofajların ve miyofibroblastların ortak kültür deneyleri, mekanik ortamın ve ortaya çıkan yüklemeye bağımlı enflamatuar ortamların miofibroblastların fenotipini modüle ettiğini göstermiştir. 20 günlük hemodinamik yüklemeden sonra, miyofibroblast belirteçlerinin gen ekspresyumu, yüklemenin bireysel ve kombine etkisinde ve makrofajların miyofibroblastlar üzerinde doğrudan ve parakrin sinyalizasyonunda net farklılıklar göstermiştir (Şekil 6A). Ayrıca, contractile marker alfa düz kas aktisin gen ekspresyon kalıpları protein sentezi ile ilişkilidir (Şekil 6B). Ayrıca, döngüsel streç kollajenöz ve elastik matris gen ekspresyon ve zayıflatılmış matris metalloproteinaz 1/doku inhibitörü matris metalloproteinaz 1 aracılı kollajen remodeling uyarılmışken, eş kültürde kesme stresinin dengeleyici bir etkisi gözlenmiştir (Şekil 6C). Bu uzun süreli ortak kültür deneyleri, bu biyoreaktör ile doku mühendisliği vasküler greftlerde çeşitli hemodinamik yükleme rejimlerinde daha sonraki aşama doku tadilat fazını (Şekil 4A) inceleme olasılığını göstermektedir. TEVG silikon bir tüpe "içten dışa" monte edildiği için, dairesel streç ve WSS daha uzun kültür dönemleri için uygulanabilir.

Şekil 1: Biyoreaktörün tasarımı ve genel görünümü. (A) Biyoreaktör tabanının inşaat çizimi ve (B) tüm parçaları belirtilen sıvı kültür odasının patlamış görünümü (adım 2.4–2.8). Akış kültürü odasının üst bölmesi bir akış düzleştiricisi tutar. (C) Küresel olarak körelmiş burun konisi, akışı açısal kanaldan (pembe ile gösterilen akış yönü) dağıtmak için akış düzleştiriciden sonra konumlandırılır. (D) Bu bileşenler birlikte akış yönünü kontrol eder ve yönlendirin. Tek tek bahsedilen parçaların işlevsel bir açıklaması için Tablo 1'e bakın. (E) Komple biyoreaktör kurulumunun fotoğrafı (adım 5.2) ve (F) akış kültürü odalarının ve pnömatik silindirin (adım 5.6.1)yakından görünümü. (G) Tohumlamadan önce elektrospun PCL-BU iskelesinin brüt görünümü (cetvel 1 mm'yi işaretler). Farklı büyütmelerde 3 mm iç çapı ve 5 μm ortalama fiber çapı olan tübüler elektrospun PCL-BU iskelesinin elektron mikroskobik görüntülerinin taranması, ölçek çubukları (H) 100 μm ve (I) 10 μm (adım 1.3). (J) Dış yarıçapı (r₁) iç yarıçaplı bir cam tüpte ortalanmış boru şeklinde bir elektrospun iskeleden oluşan kültür odasının şematik görüntüsü (r₂). Akış (Q) giriş ve çıkışları halka halkasına bağlanır, duvar kesme stresi (t) uygulamak için kanal yüksekliği h ile. Basınç/streç (P) girişi, monte edilen elektrospun iskelelerine içeriden çevresel bir streç (φ (t) uygulamak için silikon monteli iskeleye bağlanır (adım 6.1). Kısaltmalar: polikaprolactone bisurea (PCL-BU). C, D ve G–J panelleri Van Haaften ve ark.^19'danuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Biyoreaktör parçaları	İşlevsel açıklama
Uygulamayı uzat
Pnömatik silindir	Teflon körükleri harekete yorlar.
Teflon körük	Hidrolik hazneyi yükler.
Hidrolik rezervuar	8 adede kadar akış kültürü odası ile bağlanabilir, demi suyu ile doldurulur, silikona monte edilmiş yapılara basınç uygular.
Vida ipliği	Akış kültürü odası ve hidrolik rezervuar arasındaki bağlantı. Silikona monte yapılar için basınç girişi.
Beyaz bağlayıcı	Akış kültürü odasını hidrolik rezervuar/ biyoreaktör tabanındaki sekiz vida ipliğinden birine sıkıca vidalamak için kullanılır.
Küçük delikli basınç kanalı	Hidrolik rezervuardaki su ile doğrudan bağlantılıdır. Hidrolik rezervuar basınçlandırıldığında, basınç kanalları silikon boru arasındaki boşluğu (basınç kanalına monte edilen) suyla doldurur, silikon boruyu dışarıya doğru iter, bu da silikona monte greftin içinden çevresel bir esnemeye neden olur.
Silikon boru	Elektrospun greftini basınç kanalına monte etmek için. Silikon boru çevresel olarak içeriden gerilir.
Akış uygulaması
Akış pompası sistemi	Akış kültürü odalarındaki akışı kontrol etmek için kullanılır. (örneğimizde: bir ibidi pompa sistemi kullanılır.)
Akış giriş ve çıkışlı üst ve alt bölme	Akış kültürü odasını akış döngüsüne bağlar.
Cam tüp	Merkezde basınçlı iskeleyi içerir ve iskelelerin perfüzyonunu sağlar.
Akış düzleştirici	Akışı nispeten kısa bir çökeltme uzunluğunda stabilize eder.
Burun konisi	Akışı eşit olarak dağıtır.
Adaptör burçları	Cam tüpü tamir eder.
Silikon O-halka	Ortamın sızmasını önler.

Tablo 1: Biyoreaktör ana özelliklerinin fonksiyonel tanımı, Şekil 1A-D'de belirtilen parçalara karşılık gelir.

Şekil 2: Protokoldeki kritik adımların yanlış yürütülmesinin sonuçları. Kritik adımlar doğru şekilde gerçekleştirilmediğinde biyoreaktör kurulumunda gözlemlenebilen bazı oluşumların fotoğrafları. (A) Düğüm yeterince sıkı değilse veya tam olarak oyulmuş oluğa yerleşmiş değilse (okla gösterilir), akış kültürü odasına hafif bir hidrolik sıvı sızıntısı meydana gelebilir(adım 2.5). (B) Teflon körük deneyden bir gün önce veya silikon halka iyi yerlenmediğinde O/N'yi genişletmesine izin verilmediyse, vida iplikleri ile biyoreaktör tabanı arasındaki bağlantıda hidrolik sıvıdan hidrolik sıvı sızıntısı meydana gelebilir (okla gösterilir) (adım 1.4 ve 5.2.3). (C) Akış kültürü odasındaki hava kabarcıkları (okla gösterilir) rahatsız edici kesme stres kalıplarına neden olur. Her zaman kültür ortamını gazdan arındırın ve orta rezervuarlardaki orta seviyelerin, bir rezervuarın kurumasını ve havanın akış odası sistemine emilmesini önlemek için dengelendiğini emin olun (adım 1.2 ve 5.5.4). (D) Alt bölmedeki silikon halka doğru yerlere yerlenmediğinde, ortamın dökülmesi gözlenebilir (okla gösterilir) (adım 2.4.2). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kesme stresi ve esnemesinin kontrolü. Biyoreaktör, streç ve kesmenin bağımsız ve birleşik uygulanmasına izin verdiğinden, (A) birden fazla deney grubu bir deneye dahil edilebilir. (B) Dört ayrı sistem ayarı altında test edilen belirli bir zamanda (renklerle gösterilir) maksimum esneme ve kesme gerilmelerindeki değişim örnekleri. Siyah dikdörtgenler, her ayar için ölçümlerin ortalama ± standart sapması anlamına gelir. Noktalı çizgiler, dört ayrı yükleme koşulunun belirtmek için esnemelerin ortalaması (yatay çizgi) ve kesme gerilmeleri (dikey çizgi) olarak hesaplanır. (C) Yüksek hızlı kamera zaman atlamalı izlenen iskele yapılarının dış çap ölçümlerine dayanarak, 20 günlük deney boyunca döngüsel streç ve kombine gruplarda döngüsel çevresel esnemeler (adım 6.2). (D) Şırınnadaki değişen orta seviyelere (adım 6.1)dayanarak, deney boyunca kesme stresindeki ve birleşik gruplardaki izlenen duvar kesme gerilmeleri. Paneller A, C ve D, Van Haaften ve Wissing ve ark.^44'tenuyarlanmıştır; panel B, Van Haaften ve ark.^19'danuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Yerinde vasküler doku mühendisliği kavramı, hücre dağılımı, doku üretimi ve iskele bozulması. (A) Konağın fonksiyonel yerinde iskele güdümlü doku yenilenmesinin hipotezli evrelerini gösteren şematik bir illüstrasyon. Gösterilen sonuçlar, makrofajların ve doku üreten hücrelerin iskele malzemesini kolonileştirdiği proliferatif faza odaklanan deneylerden elde edilir. (B) Elektrospun iskelesinin dış tarafında insan saphenöz damarından(kırmızı) ve PBMC türevi makrofaj(yeşil) dağılımından myofibroblastlar (gri) 3. Ölçek çubuğu 200 μm. (C) Kollajen tip I (yeşil), kollajen tip III (kırmızı) ve DAPI (beyaz) için lekeli 20. Ölçek çubuğu 100 μm, *yapının akış tarafına karşılık gelen dış tarafını gösterir. (D) Makrofaj bozulmasını gösteren 8 günlük makrofaj monokültürünün hücreden arındırılanmış greftlerinin SEM görüntüleri; ölçek çubuğu 20 μm. Kısaltmalar: insan saphenöz venöz hücreleri (HVSC); periferik kan mononükleer hücre (PBMC); 4′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI); tarama elektron mikroskopisi (SEM). Panel A, Wissing ve Bonito ve ark.^27'denuyarlanmıştır; B ve C panelleri Van Haaften ve Wissing ve ark.^44'tenuyarlanmıştır; ve panel D Wissing ve ark.^43'tenuyarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Hemodinamik olarak yüklenen ortak kültür yapılarında enflamatuar ortam 3 gün ve 20 günde inşa edilir. İnsan PBMC türevi makrofajların ve saphenous damarlardan insan miyofibroblastlarının ortak kültürü. (A) Multipleks ELISA ile süpernatant olarak ölçülen toplam sitokin salgısının ısı haritası. (B) 20. günde sitokin seçimi için boxplots, toplam DNA içeriğine normalleştirilmiştir. P değerleri, Bir Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi ile Kruskal-Wallis testi kullanılarak hesaplandı; * s < 0.05, ** p < 0.01, *** Kısaltmalar: metalloproteinaz doku inhibitörü (TIMP), matris metalloproteinaz (MMP), interlökin (IL), monosit kemoattraktant protein 1 (MCP-1), büyüme faktörü beta 1'i dönüştürme (TGF-β1), bağ dokusu büyüme faktörü (CTGF), tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α), trombositten türetilmiş büyüme faktörü (PDGF), statik (ST), döngüsel streç (CS), kesme stresi (SS). Paneller A ve B, Van Haaften ve Wissing ve ark.^44'tenuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: 20. günde vasküler yapılarda hemodinamik yüklemeye yanıt olarak miyofibroblast fenotip ve matris büyüme ve yeniden şekillendirme belirteçlerindeki değişiklikler. (A) Miyofibroblast spesifik fenotipik belirteçlerin göreceli gen ekspresyumu. (B) αSMA (yeşil) ve DAPI (mavi), ölçek çubuğu 100 μm için lekeli kesitler. (C) Kollajen matrisi, elastik matris, proteoglikanlar ve yeniden şekillendirme genleri ile ilgili genlerin göreceli ekspresyolü. P değerleri, Bir Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi ile Kruskal-Wallis testi kullanılarak hesaplandı; * s < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. Kısaltmalar: S100 kalsiyum bağlayıcı protein A4 (S100A4), alfa-düz kas aktin (αSMA veya ACTA2), calponin 1 (CNN1), smoothelin (SMTN), vimentin (VIM), kollajen I (COL1A1), elastin (ELN) ), versican (VCAN), matris metalloproteinaz (MMP), metalloproteinaz doku inhibitörü (TIMP), statik (ST), döngüsel streç (CS), kesme stresi (SS), 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI). # algılama sınırında veya altında ölçülür. Paneller A, B ve C, Van Haaften ve Wissing ve^ark. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Protein ekspresyumu myofibroblast ve makrofaj-monokültürler bireysel ve kombine hemodinamik yüklere maruz kalır. (A) Akran lifleri (yeşil), çekirdek (kırmızı) ve iskele (mavi) ile 10 gün boyunca kültürlenen miyofibroblastların temsili konfokal görüntüleri, tercihli aksin lif yönünün gözlenemeyeceği statik örneklerle karşılaştırıldığında, yüklenen örneklerde net bir akran lifi yönelimi gösterir. Ölçek çubuğu 50 μm. (B) Kollajen (yeşil) ve çekirdek / iskele (beyaz) için boyanmış aynı myofibroblast monokültür konfokal görüntüleri. Ölçek çubuğu 50 μm. (C) Statik ve dinamik kültürlü THP1 türevi makrofajların protein salgı profillerinin boxplotları 8 gün boyunca, IL-6, TNF-α, MCP-1 (pro-enflamatuar) ve IL-10, IL-13, MMP-9 (anti-enflamatuar) sitokin salgı seviyelerine göre hesaplanan M1/M2 oranları ile. MCP-1 grafiğindeki nokta istatistiksel bir aykırıyı temsil eder. (D) Pro-enflamatuar, antienflamatuar, büyüme ve yeniden şekillendirme proteinlerinin ortalama salgılanmasına kıyasla 8. günde statik ve dinamik kültürlü makrofajların göreli protein salgılama seviyelerinin ELISA verileri (protein düzeyleri grup başına ortalama DNA içeriği için düzeltildi). Noktalar ve gölgeli alanlar sırasıyla 50 ve 25.-75. Kısaltmalar: monosit kemoattraktant protein 1 (MCP-1), interlökin (IL), dönüşüm büyüme faktörü beta (TGF-β), matris metalloproteinaz (MMP), trombosit türevi büyüme faktörü (PDGF), bağ dokusu büyüme faktörü (CTGF), tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α), enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA).* p < 0.05; ** s < 0.01, *** p < 0.001. A ve B panelleri Van Haaften ve ark.^19'danuyarlanmıştır. C ve D panelleri Wissing ve ark.^43'tenuyarlanmıştır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Burada açıklanan biyoreaktör, borulu rezonanslı iskelelerde kesme stresi ve döngüsel esnemenin iltihaplanma ve doku yenilenmesi üzerindeki bireysel ve kombine etkilerinin sistematik olarak değerlendirilmesini sağlar. Bu yaklaşım aynı zamanda temsili sonuçlar bölümünde de örneklendirildiği gibi damar yapıları üzerinde çok çeşitli analizler yapılmasına olanak sağlamaktadır. Bu sonuçlar, farklı hemodinamik yükleme rejimlerinin (yani, farklı kesme ve esneme kombinasyonlarının) TEVG yapısında hem büyüme hem de yeniden şekillendirme üzerindeki ayırt edici etkisini göstermektedir. Bu in vitro platform aracılığıyla toplanan bu içgörüler, yeni geliştirilen in situ TEVG'ler için iskele tasarım parametrelerinin optimizasyonuna yardımcı oluyor. Uygun bir deneysel iş akışı sağlamak için, kritik adımların ve bu protokolün sınırlamalarının anlaşılması önemlidir.

Protokoldeki en kritik adımlar, numunelere esneme uygulamasıyla ilgilidir. Streç uygulama için kurulumun sızdırmaz olması önemlidir. Sistemde iki zayıf nokta vardır: elektrospun greftlerini basınç kanallarına monte eden düğümler ve biyoreaktör tabanı ile akış kültürü odaları arasındaki bağlantı. 2.5.2 ve 2.5.4 adımlarında açıklandığı gibi, çoklu, sıkı düğümler tam olarak oyma oluğa konumlandırılmalıdır. Düğüm yeterince sıkı değilse veya oluğun biraz üstüne veya altına yerleştirilirse, akış kültürü odasına hafif bir hidrolik sıvı sızıntısı meydana gelebilir. Bu sızıntı, hidrolik rezervuarda bir basınç düşüşü ve ayarlanan basınç değerine ulaşmak için gerinim pompasında sürekli artan bir voltaj olarak tespit edilebilir. Ayrıca, bu akış kültürü odasında rahatsız bir akışa, hücre kültürünün kirlenme riskinin artmasına ve ortamın seyreltilmesine yol açar. Bu olduğunda, akış kültürü odasının deneyden çıkartılması ve hidrolik rezervuardaki vida ipliğinin beyaz bir Luer kapağı ile kapatılması gerekir. Diğer yedi akış kültürü odası için deneyin doğru bir şekilde devamını sağlamak için gereken tam bir numune almanın bu önemli ölçüsü, tam olarak oyulmuş oluklara sıkı düğümlerin doğru bir şekilde yerleştirilmesinin önemini vurgulamaktadır. Ancak o zaman hidrolik rezervuardaki su ile akış kültürü odalarındaki ortam arasında uygun ayırma sağlanabilir. İskelelerin montajının sağlamlığını artırmak için, basınç kanallarındaki oluklar biyoreaktörün revize edilmiş bir versiyonunda biraz daha derin hale getirilecek ve daha kolay ve daha iyi düğüm yerleşimi ve böylece hidrolik sıvının ortamdan güvenli bir şekilde ayrılmasına izin verilecektir.

Bir diğer potansiyel sızıntı kaynağı, biyoreaktör tabanının vida iplikleri ile akış kültürü odasının beyaz Luer konektörleri arasındadır. Teflon malzemenin olası aşınması ve yıpranması nedeniyle, sızıntıyı önlemek için ekstra bir silikon O-halka eklenebilir (adım 5.2.3). Ayrıca, gerinim pompasının Teflon körüklerinin deneyden bir gün önce O / N'yi hafifçe genişletmesine izin verilmelidir (adım 1.4). Sızıntı meydana gelirse, kayıp hidrolik sıvı sekiz vida ipliğinden biri aracılığıyla az miktarda ultra saf su eklenerek telafi edilmelidir (iğneli ve esnek telli bir şırınga kullanın). Akış kültürü odasının alt bölmesine vida ipliği ile beyaz Luer konnektörü arasına küçük bir parafilm parçası ile akış kültürü odasını geri yerleştirin. Gelecekteki deneylerde bu sızıntı sorununun üstesinden gelmek için, biyoreaktör tabanındaki mevcut Teflon vida iplikleri, sistemin aşınmasını önlemek için biyoreaktörün yeni nesil versiyonundaki paslanmaz çelik dişlerle değiştirilecektir.

Streçteki varyasyon (Şekil 3C) WSS'deki varyasyondan daha büyüktür (Şekil 3D), çünkü streç kontrol etmek daha zordur. Bununla birlikte, sızıntıyı önleme önlemlerinin yanı sıra, esneme varyasyonunu sınırlayan başka önlemler de vardır: (i) flütteki hava kabarcıklarından kaçınmak (adım 1.4 ve 5.2.1), (ii) farklı numuneler arasında tutarlı ön esneme sağlamak (adım 2.5.3) ve (iii) farklı numuneler arasında tutarlı iskele özellikleri sağlamak (adım 1.3).

Son olarak, elektrospun iskelesini silikon boruya monte ederken ekstra dikkatli olmak gerekir (adım 2.3). Özellikle, kırılgan elektrospun iskelesinin gerilmiş silikon borunun üzerine çekilmesi gerektiğinde, elektrospun greftinin zarar görmesini önlemek için, özellikle elektrospun greftinin iç kısmında çok fazla kuvvet uygulanmaması önemlidir. Elektrospun greftinin iç kısmında, güçlü çekme veya silikon tüpün çok zayıf gerilmesinden hasar meydana gelirse, elektrospun liflerindeki hasarın boyutu ancak yapı hasat edildikten ve analiz edildikten sonra görünür hale gelir. Mevcut kurulumda, tohumlamanın başarısı ancak numuneden ödün verdikten sonra immünofluoresans veya immünohistokimyasal analiz ile doğrulanabilir. Bununla birlikte, hücre taşıyıcısı olarak fibrin ile tohumlama prosedürü, tipik olarak yeterince büyük gözenek boyutuna sahip iskeleler için homojen bir hücre dağılımına yol açan iyi kurulmuş bir yöntem^67'dir. Hücre tohumlama ile ilgili en önemli yönlerden biri, iskelenin tohumlamadan önce mümkün olduğunca kuru olmasını sağlamaktır (adım 4.4), hücrelerle birlikte fibrin jelinin ıslak iskeleden geçmesini önlemek ve bu da inhomogeneöz tohumlama ile sonuçlanır. Son olarak, elektrospun greftinin UV radyasyonu ile arındırma ve % 30 etanol içine daldırma yöntemi, in vivo çalışmalar için hazırlanan elektrospun greftlerinin sterilizasyonu kadar katı olmasa da, genellikle etilen oksit veya gama ışınlama ile sterilize edilen, herhangi bir bulaşma belirtisi olmadan 20 güne kadar sürebilen in vitro kültür deneyleri için yeterlidir (örneğin, bkz. Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6ve Van Haaften ve Wissing (2020)⁴⁴). Ayrıca, burada kullanılan PCL-BU malzemesi, yüksek etanol konsantrasyonlarına uzun süre maruz kalmasına izin vermez. Kullanılan malzemeye bağlı olarak en uygun sterilizasyon yöntemi seçilebilir.

Daha önce yapılan ortak kültür çalışmalarının sonuçlarına ek olarak, aynı sistemle daha geniş bir çalışma çeşitliliği gerçekleştirilebilir. Sistem daha önce miyofibroblastların dinamik monokültürlerini (Tamamlayıcı Şekil 1A-B) ve makrofajları (Tamamlayıcı Şekil 1C-D) gerçekleştirmek için hemodidinamik yüklemenin bireysel hücre tipleri üzerindeki etkilerini ve parakrin sinyallerini araştırmak için^19,43. Farklı hemodinamik yükleme rejimleri, 10 gün sonra miyofibroblastlarda(Ek Şekil 1A)ve belirgin şekilde farklı kollajen birikiminde(Ek Şekil 1B)net aktin lif yönelimi ile sonuçlandı. THP1 türevi makrofajlar tarafından sitokin üretimi, farklı hemodinamik yükler (Tamamlayıcı Şekil 1C) arasında büyük ölçüde farklıydı ve yüklendiğinde daha pro-enflamatuar bir profil gösterdi(Ek Şekil 1D). Diğer doğrulanmış olasılıklar arasında, ekstra bir pompa ve akışkan ünite kullanılarak salınımlı akışın uygulanması yer almaktadır. Ortamın viskozitesi kan viskozitesi aralığına doğru arttırılabilir (örneğin, ksanthan sakızı eklenerek)⁶⁹. Orta viskozitenin modüle etmesi, uygulanabilir kesme gerilmelerinin aralığını genişletmek için ek bir değişkeni temsil eder. Son olarak, açıklanan protokolde 'İbidi' akış şartlandırma kurulumu kullanılsa da, benzer akış rejimleri uygulanabildiği sürece diğer üreticilerin kurulumları da kullanılabilir.

Bu biyoreaktör sistemini kullanmanın en büyük avantajlarından biri, hemodinamik olarak yüklenebilen ve tek bir numuneden çok çeşitli olası okuma parametrelerinin çıkarılmasını sağlayan nispeten büyük yapıdır (yaklaşık 15 mm x 10,5 mm). Aynı zamanda, yapı boyutu da bir sınırlama olarak görülebilir, çünkü bu kurulum, özellikle birincil hücreler kullanılıyorsa veya kültür ortamı maliyetli katkı maddeleri gerektiriyorsa, nispeten büyük miktarda (bazen maliyetli) malzeme gerektirir. Ayrıca, kurulumun aktarım hızı nispeten düşüktür. Sonuç olarak, mevcut kurulum, sınırlı okuma ile çok sayıda değişkenin taranması yerine, sınırlı sayıda değişkenin kapsamlı bir şekilde test edildiği hipotez odaklı araştırmalar için özellikle uygundur. Gelecekteki deneyler için, daha küçük iskelelerin monte edilmesi ve orta rezervuarların boyutunun küçültilmesi seçeneğini etkinleştirmek için mevcut kurulumda küçük iyileştirmeler yapılmaktadır. İkincisi ile ilgili olarak, istenen kesme gerilmelerine ulaşmak için yeterli hacimsel akış hızlarını sağlamak için orta rezervuarların mevcut hacmi gereklidir. Gerekli akış hızları (ve bununla birlikte, orta rezervuarların hacmi), ortamın viskozitesi artırılarak azaltılabilir (örneğin, daha önce kurulduğu gibi ksanthan sakızı eklenerek^69).

Sonuç olarak, bu biyoreaktör, kesme stresinin ve döngüsel esnemenin doku büyümesi ve çok çeşitli elastomerik 3D biyomalzeme iskeleleri üzerinde yeniden şekillendirilmesi üzerindeki bireysel ve birleşik etkilerinin ölçülmesine izin verir. Biyoreaktör, çeşitli yükleme koşullarında sekiz vasküler yapıya kadar kültüre edebilir. Tasarımı sayesinde, biyoreaktör özellikle hemodinamik ve yerinde vasküler TE süreçleri arasındaki etkileşimi incelemek için uygundur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM)	Gibco	12491-015	cell culture medium for fibroblasts
Aqua Stabil	Julabo	8940012	prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombin	Sigma	T4648	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Centrifuge	Eppendorf	5804	to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor - "kelly forceps"	Almedic	P-422	clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubators	Sanyo	MCO-170AIC-PE	for cell culturing
Compressed air reservoir	Festo	CRVZS-5	smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretches	Matlab	R2017. The Mathworks, Natick, MA	calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition board	National Instruments	BNC-2090	data processing in between amplifier system and computer
Ethanol	VWR	VWRK4096-9005	to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS)	Greiner	758087	cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipet	Assistant	HE40567002	apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamber	Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology	n.a.	part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMax	Gibco	35050061	cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed camera	MotionScope	M-5	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens	Nikon	JAA616AB	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clip	ibidi GmbH	10821	block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads	ibidi GmbH	10902	set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)	Swann Morton	0301; 0933	to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW Software	National Instruments	version 2018	to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV light	Labconco	302310001	to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishes	Greiner	664-160	for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)	Sigma	A8960	cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500	Zeiss	Schott AG	to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps	ibidi GmbH	various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)	to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS)	PEEKEL instruments B.V.	n.a.	to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders	ibidi GmbH	10974	medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter	Rubber BV	1805	to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio Software	Idtvision	2.15.00	to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G)	BD Microlance	301700	together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driver	Adson	2429218	to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissues	Kleenex	38044001	for cleaning of the equipment with 70% ethanol
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	quick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S)	Lonza	DE17-602E	cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	for storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw caps	Greiner	206202	to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinder	Festo	AEVC-20-10-I-P	to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length)	SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands	n.a.	produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control)	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducer	BD	TC-XX and P 10 EZ	the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensor	Festo	MPPES-3-1/8-2-010, 159596	provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)	Gibco	A1049101	cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)	Eppendorf	30120086	multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20%	Sigma	5030	Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.
Silicone O-rings	Technirub	1250S	to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)	Rubber BV	1805	to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL)	Falcon	352095	multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle	Ethicon, Johnson&Johnson	EH7404H	Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL)	B. Braun Melsungen AG	2057932	to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm)	Satorius	17597-K	to filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter cap	Nunc	178983	to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter cap	Nunc	156499	to culture static control samples
Teflon bellow	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel)	PolarWare	15-248	for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
Tweezers	Wironit	4910	sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure water	Stakpure	Omniapure UV 18200002	to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV light	Philips	TUV 30W/G30 T8	for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding