Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos
Summary
Aquí describimos la adquisición óptica y la caracterización de potenciales de acción de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas utilizando un sistema de fotometría modular de alta velocidad.
Abstract
Las técnicas convencionales de microelectrodos intracelulares para cuantificar la electrofisiología de cardiomiocitos son extremadamente complejas, requieren mucha mano de obra y, por lo general, se llevan a cabo con bajo rendimiento. La expansión rápida y continua de la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) presenta un nuevo estándar en la investigación cardiovascular y ahora se necesita métodos alternativos para aumentar el rendimiento de los datos electrofisiológicos a nivel de una sola célula. VF2.1Cl es un tinte sensible al voltaje recientemente derivado que proporciona una respuesta rápida de un solo canal y de alta magnitud a las fluctuaciones en el potencial de membrana. Posee una cinética superior a las de otros indicadores de tensión existentes y pone a disposición datos funcionales equivalentes a los de las técnicas tradicionales de microelectrodos. Aquí, demostramos una caracterización simplificada y no invasiva del potencial de acción en cardiomiocitos humanos derivados de iPSC de ritmo externo utilizando un sistema de fotometría modular y altamente asequible.
Introduction
El modelado electrofisiológico de cardiomiocitos y la construcción de plataformas eficientes para el cribado de fármacos cardíacos es esencial para el desarrollo de estrategias terapéuticas para una variedad de trastornos arrítmicos. La rápida expansión de la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) ha producido avances prometedores en el modelado de enfermedades humanas y la investigación farmacológica utilizando cardiomiocitos aislados derivados de pacientes (iPSC-CM). Las técnicas “estándar de oro” para la caracterización electrofisiológica de estas células a través de patch-clamp (current-clamp) pueden cuantificar la morfología y la duración del potencial de acción (AP), sin embargo, este método es increíblemente complejo y lento, y no es adecuado para la adquisición de datos de alto rendimiento1. Se informa regularmente que los iPSC-CMs tienen un mayor potencial de membrana diastólica y una mayor corriente de fuga en comparación con los cardiomiocitos nativos adultos2. Se sugiere que el tamaño celular más pequeño y la capacitancia de membrana reducida observada en iPSC-CMs pueden producir algún error sistemático al usar la técnica de pinza de corriente, tal vez explicando estas desviaciones3. Con el fin de maximizar la utilidad de una plataforma iPSC-CM, un método adicional es valioso para aumentar el rendimiento y garantizar la precisión de los datos al caracterizar los cambios de voltaje transmembrana a nivel de una sola celda en iPSC-CM.
Los colorantes sensibles al voltaje (VSD) han sido durante mucho tiempo un método propuesto para proporcionar un análisis más rápido, no invasivo y equivalente de la cinética cardíaca de AP comparativa con las de las técnicas tradicionales4. Un estudio reciente ha demostrado la idoneidad de la fotometría de sonda sensible al voltaje ratiométrico para cuantificar con precisión el APcardíaco 5. Además, la capacidad de ampliar fácilmente los enfoques de fotometría óptica presta esta técnica a pruebas de cardiotoxicidad a gran escala críticas en el desarrollo de fármacos terapéuticos (por ejemplo, CiPA). El desarrollo de protocolos estandarizados de cardiotoxicidad en un estudio cegado de múltiples sitios utilizando matriz de microelectrodos y técnicas ópticas de detección de voltaje ha demostrado el valor clave de este enfoque6.
Muchos colorantes potenciométricos están disponibles comercialmente, y el desarrollo sintético en curso de nuevas sondas muestra un potencial emocionante para racionalizar su efectividad en una variedad de construcciones cardíacas y neuronales. El VSD ideal tendrá una cinética y sensibilidad aumentadas, al tiempo que mostrará una menor carga capacitiva, fotobleaching y citotoxicidad. El recientemente sintetizado VF2.1Cl (FluoVolt) expresa muchas de estas propiedades beneficiosas en gran parte debido a su novedosa estructura molecular basada en cables, compartida por otros miembros de la nueva familia VoltageFluor (VF)7. A diferencia de los VSD electrocrómicos comunes en los que sondas simples se conjugan molecular y eléctricamente con la membrana plasmática, este tinte consiste en un alambre sintético insertado pasivamente que abarca la membrana que empareja un donante rico en electrones con un fluorescéforo de fluoresceína modificado (FITC). Los detalles mecanicistas se proporcionan en la Figura 1. Este tinte demuestra una excelente sensibilidad a las fluctuaciones de voltaje de la membrana, mostrando un cambio del 27% en la intensidad de emisión por 100 mV en comparación con ~ 10% visto en otras sondas comunes a velocidades comparables7. Además, los sistemas PeT basados en cables no interactúan directamente con el campo eléctrico celular, lo que produce una interferencia eléctrica mínima y cambios insignificantes en la carga capacitiva celular.
Figura 1: Parámetros químicos, espectrales y mecanicistas del colorante VF2.1Cl. (A) Estructura química de VF2.1Cl. Las características moleculares a tener en cuenta incluyen múltiples grupos alquilo dentro del alambre molecular de fenileno vinileno que facilitan la inserción en la membrana plasmática. Un grupo de ácido sulfónico cargado negativamente conjugado a la sonda FITC asegura la estabilización del fluoróforo en la superficie extracelular y ayuda a la inserción casi perpendicular en relación con el campo eléctrico de la bicapa lipídica. (B) Un esquema simplificado de la incrustación perpendicular vf2.1Cl en la membrana plasmática de una célula diana. (C) Espectros de absorción y emisión del colorante VF2.1Cl. Spectra es idéntico al de las sondas ESTÁNDAR FITC y GFP. (D) Representación del modo de acción mecanicista de VF2.1Cl. En condiciones de reposo (hiperpolarizadas), los voltajes intracelulares negativos impulsan los electrones libres hacia el fluoróforo rostral. La abundancia de electrones asegura que la transferencia de electrones fotoinducida (PeT) se favorezca como una vía para salir del estado excitado después de la excitación óptica, apagando efectivamente la fluorescencia. Por el contrario, un potencial de membrana despolarizada influye en el movimiento de electrones hacia abajo favoreciendo la fluorescencia sobre la excitación óptica. La respuesta fluorescente resultante está linealmente relacionada con el voltaje de la membrana y se puede utilizar con precisión para recopilar información temporal detallada sobre la cinética electrofisiológica celular. (E) Imágenes representativas de campo brillante (superior) y fluorescencia a 470 nm (inferior) de cardiomiocitos de leporina cargados con VF2.1Cl. (F) Z stack de un solo cardiomiocito cargado. Las flechas indican áreas de clara localización de VF2.1Cl a la membrana celular. Las imágenes se adquirieron con un sistema confocal de disco giratorio que consiste en una cabeza confocal de disco giratorio X-lightv3 con un patrón estenopeico de 50 μm; Iluminador LDI-7; Cámara Prime95B y un objetivo PlanApo Lambda 100x. Barra de escala: 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La sonda FITC conjugada a VF2.1Cl garantiza que se pueda utilizar de manera efectiva en configuraciones de filtro estándar y GFP, y solo requiere un sistema de adquisición de un solo canal, que son características comunes de las plataformas de imágenes fluorescentes. El análisis de monocapas iPSC-CM humanas densas con este tinte se ha reportado recientemente8,9,10,11. Nuestro protocolo difiere de estos estudios debido a nuestra investigación de iPSC-CMs únicos y aislados, imperturbables por las influencias eléctricas y paracrinas de las monocapas sincitiales densas, y nuestro uso de un sistema de fotometría asequible y personalizable en lugar de complejos arreglos de imágenes confocales o de campo amplio.
Aquí, describimos nuestro protocolo para la rápida adquisición y análisis de AP ópticos robustos a partir de cardiomiocitos humanos aislados derivados de iPSC y cardiomiocitos nativos (ver Archivo Complementario). Utilizamos VF2.1Cl junto con una plataforma personalizable de última generación para mediciones de fotometría de una sola célula. Estos protocolos experimentales han sido aprobados por el comité de ética del Centro Médico Universitario de Gotinga (Nº 10/9/15).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un protocolo básico para adquirir fácilmente perfiles AP detallados a partir de iPSC-CMs aislados adecuados para el modelado electrofisiológico y la detección de fármacos cardíacos. Detectamos AP regulares y robustos de nuestros iPSC-CMs escasamente sembrados, lo que sugiere tanto la funcionalidad del indicador como la fidelidad metodológica.
Debido al amplio espectro de metodologías comerciales para la reprogramación de iPSC y la falta de estandarización para los p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Cairn Research Ltd. por su amable contribución financiera que cubrió los costos de producción de esta publicación. Además, agradecemos a la Sra. Ines Mueller y a la Sra. Stefanie Kestel por su excelente apoyo técnico.
La investigación de los autores está respaldada por el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK), la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 y bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania – EXC 2067/1- 390729940) y la Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).
Materials
| Reagents | |||
| 0.25 Trypsin EDTA | Gibco | 25200056 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-Glucose anhydrous BioChemica | ITW Reagents | A1422 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FluoVolt Membrane Potential Kit | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | BD | 354230 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| ROCK Inhibitor Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 61870010 | |
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| Equipment | |||
| 495LP Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | ||
| Circle Coverslips, Thickness 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | Molecular Devices | ||
| Dual OptoLED Power Supply | Cairn Research | ||
| ET470/40x Excitation Filter | Chroma Technology | ||
| ET535/50m | Chroma Technology | ||
| Etched Neubauer Hemacytometer | Hausser Scientific | ||
| Filter Cubes | Cairn Research | ||
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | ||
| MonoLED | Cairn Research | ||
| Multiport Adaptors | Cairn Research | ||
| Myopacer Cell Stimulator | IonOptix | ||
| Optomask Shutter | Cairn Research | ||
| Optoscan System Controller | Cairn Research | ||
| PH-1 Temperature Controlled Platform | Warner Instruments | ||
| Photomultiplier Detector | Cairn Research | ||
| PMT Amplifier Insert | Cairn Research | ||
| PMT Supply Insert | Cairn Research | ||
| RC-26G Open Bath Chamber | Warner Instruments | ||
| SA-OLY/2AL Stage Adaptor | Olympus | ||
| T565lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| T660lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| TC-20 Dual Channel Temperature Controller | npi Electronic | ||
| UPLFLN 40X Objective | Olympus | ||
| USB 3.0 Colour Camera | Imaging Source | ||
| Software | |||
| Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
| Clampfit 11.1 | Molecular Devices | ||
| IC Capture 2.4 | Imaging Source | ||
| Prism 8 | Graphpad |
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