İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü
Summary
Burada, yüksek hızlı modüler fotometri sistemi kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre türetilmiş kardiyomiyositlerden kaynaklanan eylem potansiyellerinin optik edinimi ve karakterizasyonu açıklanmaktadır.
Abstract
Kardiyomiyosit elektrofizyolojisini ölçmek için geleneksel hücre içi mikroelektrot teknikleri son derece karmaşık, emek yoğun ve tipik olarak düşük verimde gerçekleştirilir. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisinin hızlı ve sürekli genişlemesi kardiyovasküler araştırmalarda yeni bir standart sunun ve elektrofizyolojik verilerin verimini tek bir hücre düzeyinde artırmak için alternatif yöntemler artık gereklidir. VF2.1Cl, membran potansiyelindeki dalgalanmalara hızlı bir tek kanallı, yüksek büyüklükte tepki sağlayan yakın zamanda türetilmiş voltaja duyarlı bir boyadır. Diğer mevcut voltaj göstergelerinden daha üstün kinetiklere sahiptir ve geleneksel mikroelekrod tekniklerine eşdeğer işlevsel verileri kullanıma sunmaktadır. Burada, modüler ve son derece uygun fiyatlı bir fotometri sistemi kullanarak harici tempolu insan iPSC türevli kardiyomiyositlerde basitleştirilmiş, invaziv olmayan eylem potansiyeli karakterizasyonunu gösteriyoruz.
Introduction
Kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik modellemesi ve kardiyak ilaç taraması için verimli platformların inşası, çeşitli aritmik bozukluklar için terapötik stratejilerin geliştirilmesi için gereklidir. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisinin hızlı genişlemesi, izole hasta türevli kardiyomiyositler (iPSC-CM) kullanılarak insan hastalığı modellemesi ve farmakolojik araştırmalara umut verici yollar üretmiştir. Bu hücrelerin yama kelepçesi (akım kelepçesi) yoluyla elektrofizyolojik karakterizasyonu için “altın standart” teknikler, eylem potansiyelini (AP) morfolojiyi ve süresini ölçebilir, ancak bu yöntem inanılmaz derecede karmaşık ve yavaştır ve yüksek verimli veri toplama için uygun değildir1. iPSC-CM’lerin düzenli olarak yetişkin yerli kardiyomiyositlere kıyasla diastolik membran potansiyelinin ve artan sızıntı akımının arttığı bildirilmektedir2. iPSC-CM’lerde gözlenen daha küçük hücre büyüklüğü ve azaltılmış membran kapasitansının, akım kelepçe tekniğini kullanırken, belki de bu sapmaları açıklarken bazı sistematik hatalar üretebileceği öne sürülmüştür3. Bir iPSC-CM platformunun kullanışlılığını en üst düzeye çıkarmak için, iPSC-CM’lerde transmembran voltaj değişikliklerini tek bir hücre düzeyinde karakterize ederken verimi artırmak ve veri doğruluğunu sağlamak için ek bir yöntem değerlidir.
Voltaja duyarlı boyalar (VSD) uzun zamandır geleneksel tekniklerle karşılaştırmalı olarak kardiyak AP kinetiğinin daha hızlı, non-invaziv ve eşdeğer analizini sağlamak için önerilen bir yöntemdir4. Yeni bir çalışma, kardiyak AP 5’i doğru bir şekilde ölçmek için oranmetrik voltaja duyarlı prob fotometrisinin uygunluğunugöstermiştir. Ayrıca, optik fotometri yaklaşımlarını kolayca ölçeklendirme yeteneği, bu tekniği terapötik ilaç geliştirmede kritik öneme sahip büyük ölçekli kardiyotoksikite ekranlarına (örneğin, CiPA) ödünç verir. Mikroelekrod dizisi ve voltaj algılama optik teknikleri kullanılarak körleştirilmiş çok sahalı bir çalışmada standartlaştırılmış kardiyotoksiklik protokollerinin geliştirilmesi bu yaklaşımın temel değerini göstermiştir6.
Birçok potansiyometrik boya ticari olarak mevcuttur ve yeni probların devam eden sentetik gelişimi, çeşitli kardiyak ve sinirsel yapılarda etkinliklerini kolaylaştırmak için heyecan verici bir potansiyel göstermektedir. İdeal VSD artırılmış kinetik ve hassasiyete sahip olurken, azaltılmış kapasitif yük, fotobleaching ve sitotoksiklik gösterecektir. Yakın zamanda sentezlenen VF2.1Cl (FluoVolt), bu faydalı özelliklerin çoğunu büyük ölçüde yeni VoltageFluor (VF) ailesinin diğer üyeleri tarafından paylaşılan yeni tel tabanlı moleküler yapısı nedeniyle ifade eder7. Basit probların plazma zarına moleküler ve elektriksel olarak eşleştiği yaygın elektrokromik VSD’lerin aksine, bu boya, elektron bakımından zengin bir donörü modifiye floresan florofor (FITC) ile eşleştiren pasif olarak yerleştirilmiş, membran yayılan sentetik bir telden oluşur. Mekanistik detaylar Şekil 1 ‘de verilmiştir. Bu boya, membran voltaj dalgalanmalarına karşı mükemmel hassasiyet gösterir ve karşılaştırılabilir hızlarda diğer yaygın problarda görülen ~ % 10’un aksine 100 mV başına emisyon yoğunluğunda%27’likbir değişiklik gösterir 7 . Buna ek olarak, tel tabanlı PeT sistemleri, hücresel kapasitif yükte minimum elektrik paraziti ve ihmal edilebilir değişiklikler üreten hücresel elektrik alanıyla doğrudan etkileşime girmez.
Şekil 1: VF2.1Cl boyanın kimyasal, spektral ve mekanistik parametreleri. (A) VF2.1Cl.’nin kimyasal yapısıKamuyel özellikler, plazma membranına takılmayı kolaylaştıran fenilen vinilen moleküler tel içinde birden fazla alkil grubu içerir. FITC probuna konjuge edilen negatif yüklü sülfinik asit grubu, hücre dışı yüzeyde florofor stabilizasyonu sağlar ve lipid bilayer’in elektrik alanına göre dik yerleştirmeye yakın yardımcı olur. (B) Hedef hücrenin plazma zarına gömülmek için dik VF2.1Cl’nin basitleştirilmiş şeması. (C) VF2.1Cl boya emilimi ve emisyon spektrumu. Spectra, standart FITC ve GFP problarıyla aynıdır. (D) VF2.1Cl’nin mekanistik eylem modunun tasviri. Dinlenme koşullarında (hiperpolarize), negatif hücre içi gerilimler serbest elektronları rostral florofora doğru yönlendirmektedir. Elektron bolluğu, foto-indüklenen elektron transferinin (PeT) optik uyarılmadan sonra heyecanlı durumdan bir çıkış yolu olarak tercih edilmesini sağlar ve floresanlığı etkili bir şekilde söndürür. Buna karşılık, depolarize bir membran potansiyeli, optik ekssitasyon üzerine floresandan yana aşağı doğru elektron hareketini etkiler. Ortaya çıkan floresan yanıt doğrusal olarak membran voltajı ile ilgilidir ve hücresel elektrofizyolojik kinetik hakkında ayrıntılı zamansal bilgi toplamak için hassas bir şekilde kullanılabilir. (E) Temsili brightfield (üst) ve floresan 470 nm (alt) görüntülerde leporin kardiyomiyositler VF2.1Cl. (F) Z yığını tek bir yüklü kardiyomiyosit yığını. Oklar, VF2.1Cl’nin hücresel zara net lokalizasyon alanlarını gösterir. Görüntüler, 50 μm pim deliği desenli bir X-lightv3 dönen disk konfokal kafasından oluşan bir dönen disk konfokal sistemi ile elde edildi; LDI-7 aydınlatıcı; Prime95B kamera ve PlanApo Lambda 100x hedef. Ölçek çubuğu: 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
VF2.1Cl’ye eşlenen FITC probu, standart ve GFP filtre yapılandırmaları altında etkin bir şekilde kullanılabilmesini sağlar ve her ikisi de floresan görüntüleme platformlarının ortak özellikleri olan tek bir kanal alma sistemi gerektirir. Bu boya ile yoğun insan iPSC-CM monolayerlerinin analizi son zamanlardabildirilmiştir 8,9,10,11. Protokolümüz, yoğun senkriyal monolayerlerin elektriksel ve parakrin etkilerinden etkilenmeyen tek, izole iPSC-CM’leri araştırmamız ve karmaşık konfokal veya geniş alan görüntüleme düzenlemelerinin aksine uygun fiyatlı ve özelleştirilebilir bir fotometri sistemi kullanmamız nedeniyle bu çalışmalardan farklıdır.
Burada, izole edilmiş insan iPSC türevi kardiyomiyositlerden ve yerel kardiyomiyositlerden sağlam optik AP’lerin hızlı bir şekilde alınması ve analizi için protokolümüzü açıklıyoruz (bkz. Ek Dosya). Tek hücreli fotometri ölçümleri için VF2.1Cl’i özelleştirilebilir bir sanat platformuyla birleştiğinde kullanıyoruz. Bu deneysel protokoller Göttingen Üniversitesi Tıp Merkezi etik kurulu tarafından onaylanmıştır (No. 10/9/15).
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, elektrofizyolojik modelleme ve kardiyak ilaç taraması için uygun izole iPSC-CM’lerden ayrıntılı AP profillerini kolayca elde etmek için temel bir protokol açıklıyoruz. Seyrek tohumlu iPSC-CM’lerimizden hem gösterge işlevselliğini hem de metodolojik doğruluğu öneren düzenli ve sağlam AP’ler tespit ediyoruz.
iPSC yeniden programlama için geniş ticari metodoloji yelpazesi ve kardiyak farklılaşma protokolleri için standardizasyon eksikliği nedeniyle, iPSC tabanlı m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Cairn Research Ltd.’yi bu yayının üretim maliyetlerini kapsayan nazik finansal katkıları için kabul etmek istiyor. Ayrıca, Bayan Ines Mueller ve Bayan Stefanie Kestel’e mükemmel teknik destekleri için teşekkür ederiz.
Yazarların araştırmaları Alman Kardiyovasküler Araştırmalar Merkezi (DZHK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 ve Almanya’nın Mükemmellik Stratejisi – EXC 2067/1- 390729940) ve Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20) kapsamında.
Materials
| Reagents | |||
| 0.25 Trypsin EDTA | Gibco | 25200056 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-Glucose anhydrous BioChemica | ITW Reagents | A1422 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FluoVolt Membrane Potential Kit | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | BD | 354230 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| ROCK Inhibitor Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 61870010 | |
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| Equipment | |||
| 495LP Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | ||
| Circle Coverslips, Thickness 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | Molecular Devices | ||
| Dual OptoLED Power Supply | Cairn Research | ||
| ET470/40x Excitation Filter | Chroma Technology | ||
| ET535/50m | Chroma Technology | ||
| Etched Neubauer Hemacytometer | Hausser Scientific | ||
| Filter Cubes | Cairn Research | ||
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | ||
| MonoLED | Cairn Research | ||
| Multiport Adaptors | Cairn Research | ||
| Myopacer Cell Stimulator | IonOptix | ||
| Optomask Shutter | Cairn Research | ||
| Optoscan System Controller | Cairn Research | ||
| PH-1 Temperature Controlled Platform | Warner Instruments | ||
| Photomultiplier Detector | Cairn Research | ||
| PMT Amplifier Insert | Cairn Research | ||
| PMT Supply Insert | Cairn Research | ||
| RC-26G Open Bath Chamber | Warner Instruments | ||
| SA-OLY/2AL Stage Adaptor | Olympus | ||
| T565lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| T660lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| TC-20 Dual Channel Temperature Controller | npi Electronic | ||
| UPLFLN 40X Objective | Olympus | ||
| USB 3.0 Colour Camera | Imaging Source | ||
| Software | |||
| Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
| Clampfit 11.1 | Molecular Devices | ||
| IC Capture 2.4 | Imaging Source | ||
| Prism 8 | Graphpad |
References
- Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
- Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
- Horváth, A., et al. Low resting membrane potential and low inward rectifier potassium currents are not inherent features of hiPSC-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 10 (3), 822-833 (2018).
- Salama, G., Morad, M. Merocyanine 540 as an optical probe of transmembrane electrical activity in the heart. Science. 191 (4226), 485-487 (1976).
- Hortigon-Vinagre, M., et al. The use of ratiometric fluorescence measurements of the voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS to examine action potential characteristics and drug effects on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 154 (2), 320-331 (2016).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Miller, E. W., et al. Optically monitoring voltage in neurons by photo-induced electron transfer through molecular wires. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (6), 2114-2119 (2012).
- Bedut, S., et al. High-throughput drug profiling with voltage- and calcium-sensitive fluorescent probes in human iPSC-derived cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (1), 44-53 (2016).
- McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hiPSC-derived cardiomyocytes. Frontiers in Physiology. 8, 766 (2017).
- Duncan, G., et al. Drug-mediated shortening of action potentials in LQTS2 human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 26 (23), 1695-1705 (2017).
- Asakura, K., Hayashi, S., Ojima, A., Taniguchi, T., Miyamoto, N. Improvement of acquisition and analysis methods in multi-electrode array experiments with iPS cell-derived cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 75, 17-26 (2015).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Kleinsorge, M., Cyganek, L. Subtype-directed differentiation of human iPSCs into atrial and ventricular cardiomyocytes. STAR Protocols. , 100026 (2020).
- Knollmann, B. C., Katchman, A. N., Franz, M. R. Monophasic action potential recordings from intact mouse heart: validation, regional heterogeneity, and relation to refractoriness. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 12 (11), 1286-1294 (2001).
- Leopold, J. A., Loscalzo, J. Emerging role of precision medicine in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (9), 1302-1315 (2018).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ Leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Voigt, N., et al. Cellular and molecular mechanisms of atrial arrhythmogenesis in patients with paroxysmal atrial fibrillation. Circulation. 129 (2), 145-156 (2014).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , 162 (2020).
- Gross, E., Bedlack, R. S., Loew, L. M. Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurement of the membrane dipole potential. Biophysical Journal. 67 (1), 208-216 (1994).
- Matiukas, A., et al. Near-infrared voltage-sensitive fluorescent dyes optimized for optical mapping in blood-perfused myocardium. Heart Rhythm. 4 (11), 1441-1451 (2007).
- Mutoh, H., et al. Spectrally-resolved response properties of the three most advanced fret based fluorescent protein voltage probes. PLoS One. 4 (2), 4555 (2009).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. Journal of the American Chemical Society. 137 (33), 10767-10776 (2015).
- Deal, P. E., Kulkarni, R. U., Al-Abdullatif, S. H., Miller, E. W. Isomerically pure tetramethylrhodamine voltage reporters. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9085-9088 (2016).
- Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. Spectra, membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. Biochimie. 24 (21), 5749-5755 (1985).
- Fromherz, P., Muller, C. O. Voltage-sensitive fluorescence of amphiphilic hemicyanine dyes in neuron membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 1150 (2), 111-122 (1993).
- Salama, G., et al. Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart. Journal of Membrane Biology. 208 (2), 125-140 (2005).
- Jin, L., et al. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75 (5), 779-785 (2012).
- Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., MacLaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nature Methods. 9 (1), 90-95 (2012).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nature Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
- Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knöpfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3 (6), 2514 (2008).
- Bradley, J., Luo, R., Otis, T. S., DiGregorio, D. A. Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye. The Journal of neuroscience. 29 (29), 9197-9209 (2009).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart. Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).
- Képiró, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable Myosin inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
