Caractérisation d’une nouvelle technique de culture rétinienne organotypique humaine
Summary
Cette étude vise à développer un nouveau modèle de culture rétinienne organotypique humaine (HORC) qui empêche de compromettre l’intégrité rétinienne lors de la manipulation des explants. Ceci est réalisé en cultivant la rétine avec le vitré sous-jacent et le pigment rétinien sous-jacent épithélium-choroïde (RPE-choroïde) et la sclérotique.
Abstract
Des modèles antérieurs de culture rétinienne organotypique humaine (HORC) ont utilisé des rétines détachées; cependant, sans le soutien structurel conféré par l’épithélium-choroïde pigmentaire rétinien (RPE-choroïde) et la sclérotique, l’intégrité de la rétine fragile peut facilement être compromise. L’objectif de cette étude était de développer un nouveau modèle HORC qui contient la rétine, la choroïde RPE et la sclérotique pour maintenir l’intégrité rétinienne lors de la culture d’explants rétiniens.
Après avoir coupé circonférentiellement le long du limbe pour enlever l’iris et le cristallin, quatre incisions profondes ont été pratiquées pour aplatir l’œillet. Contrairement aux protocoles HORC précédents, une tréphine a été utilisée pour couper non seulement la rétine, mais aussi la choroïde RPE et la sclérotique. Les explants à triple couche qui en ont résulté ont été cultivées pendant 72 h. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) a été utilisée pour évaluer les structures anatomiques et les explants rétiniens ont été caractérisés par immunohistochimie (IHC) pour l’apoptose, l’intégrité cellulaire de Müller et l’inflammation de la rétine. Pour confirmer la possibilité d’induction de la maladie, les explants ont été exposés à un taux élevé de glucose (HG) et à des cytokines pro-inflammatoires (Cyt), pour imiter la rétinopathie diabétique (DR). Le test de billes magnétiques Luminex a été utilisé pour mesurer les cytokines liées à la RD libérées dans le milieu de culture.
La coloration H & E a révélé des lamelles rétiniennes distinctes et des noyaux compacts dans les explantes rétiniennes avec la choroïde RPE sous-jacente et la sclérotique, tandis que les rétines sans les structures sous-jacentes présentaient une épaisseur réduite et une perte de noyaux sévère. Les résultats de l’IHC ont indiqué l’absence d’apoptose et d’inflammation de la rétine ainsi que la préservation de l’intégrité des cellules de Müller. Les tests Luminex ont montré une augmentation significative de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires associées à la RD dans les explants rétiniens exposés à HG + Cyt par rapport aux niveaux de base à 24 h.
Nous avons développé et caractérisé avec succès un nouveau protocole HORC dans lequel l’intégrité de la rétine a été préservée sans apoptose ni inflammation de la rétine. De plus, la sécrétion induite de biomarqueurs pro-inflammatoires associés à la RD lors de l’exposition des explants rétiniens à HG + Cyt suggère que ce modèle pourrait être utilisé pour des études cliniquement traduisibles sur les maladies rétiniennes.
Introduction
La rétine est une structure oculaire hautement spécialisée responsable de la transformation de l’énergie lumineuse entrante en signaux électriques, qui sont ensuite traités par le cerveau pour la perception visuelle. La rétine humaine contient une gamme dynamique de types cellulaires, très organisés dans une structure lamellaire unique composée de deux couches synaptiques et de trois couches nucléiques1 (Figure 1). L’homéostasie rétinienne est soutenue par les connexions complexes entre les cellules neurorétiniennes, les vaisseaux sanguins, les nerfs, les tissus conjonctifs etl’EPR 1. En raison de l’anatomie et de la physiologie rétiniennes sophistiquées, les mécanismes de nombreuses maladies de la rétine restent encore mal compris2,3,4,5. Pour mieux étudier les maladies de la rétine, des modèles HORC ont étédéveloppés6,7,8,9. Comparés aux études animales et aux cultures in vitro, les modèles HORC sont avantageux car ils conservent l’environnement cellulaire dynamique et les interactions neurovasculaires complexes in situ, fournissant un bon modèle pour la traduction clinique.
Figure 1: Structures oculaires postérieures de l’œil humain. Antérieures à postérieures, les couches rétiniennes sont : la couche de fibres nerveuses (NFL), la couche de cellules ganglionnaires (GCL), la couche plexiforme interne (IPL), la couche nucléaire interne (INL), la couche plexiforme externe (OPL), la couche nucléaire externe (ONL), le segment interne du photorécepteur (IS) et la couche externe du photorécepteur (OS). Les cellules de la rétine comprennent les cellules ganglionnaires (bleues), les cellules amacrines (jaunes), les cellules bipolaires (rouges), les cellules horizontales (violettes), les photorécepteurs de bâtonnets (roses) et les photorécepteurs coniques (verts). Le vitré est situé avant la rétine. L’EPR, la membrane de Bruch, la choroïde et la sclérotique sont situées postérieurement à la rétine. Notez que l’image montrée n’est qu’une représentation schématique de la rétine et que le rapport cellules/connectivité rétinienne au sein de chaque couche peut ne pas indiquer le contexte in vivo. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les protocoles HORCprécédemmentcaractérisés 6,7,8,9ont impliqué la séparation de la rétine de la choroïde RPE sous-jacente et de la sclérotique à l’aide d’une tréphine chirurgicale. Cependant, sans le soutien fourni par ces structures sous-jacentes, la rétine translucide devient fragile, difficile à manipuler et des outils tels que des pinces peuvent facilement perturber son intégrité. De plus, il a été démontré que l’isolement de la rétine en culture sans l’EPR provoque l’apoptose des cellules ganglionnaires et la dégénérescence des photorécepteurs10,11,12. Ainsi, un protocole HORC alternatif qui minimise la perte d’intégrité rétinienne et imite mieux l’environnement in vivo serait utile. Ceci est particulièrement important lors de l’étude des mécanismes de la maladie rétinienne, car les blessures physiques lors de la manipulation des explants pourraient introduire des artefacts. Par conséquent, l’objectif de cette étude était de développer un nouveau modèle HORC qui inclut la choroïde RPE et la sclérotique afin de protéger l’intégrité de la rétine pendant la manipulation et la culture des explants.
Afin d’atteindre cet objectif, des explantes rétiniennes « prises en sandwich » entre le vitré résiduel et la choroïde RPE sous-jacente et la sclérotique ont été extraites. Dans les explants sandwich, le vitré alourd la rétine pour empêcher le décollement et le repliement de la rétine, tandis que la sclérotique fibreuse et résistante agit à la fois comme un échafaudage pour le soutien structurel et un point de contact pour les forceps. De plus, des modèles animaux ont montré que la rétention de l’EPR en culture peut prévenir la dégénérescence rétinienne et la prolifération gliale, une réponse des cellules de Müller à des signaux de danger tels que l’hypoxie et l’inflammation10,11,12.
Pour caractériser le modèle, des explants rétiniens sandwich ont été colorés avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) pour évaluer les structures anatomiques et une immunohistochimie (IHC) a été réalisée, en tissant les explants avec un marquage terminal de l’extrémité de l’extrémité de la dUTP doxynucléotidyl transférase dUTP (TUNEL, un marqueur cellulaire apoptotique), une protéine acide fibrillaire gliale (GFAP, une inflammation de la rétine et marqueur d’activation cellulaire de Müller) et la vimentine, un marqueur de l’intégrité cellulaire de Müller. Pour déterminer si ce modèle peut être induit à développer des signes moléculaires de maladie, les explantes ont été exposées à un taux élevé de glucose (HG) avec des cytokines pro-inflammatoires (Cyt), de l’interleukine-1β (IL-1β) et un facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α), un environnement de culture qui a été montré pour imiter la rétinopathie diabétique (DR) dans les modèles de maladies cellulaires et animales13,14,15. Les tests Luminex ont été utilisés dans le modèle DR pour mesurer les cytokines libérées dans le milieu de culture.
Protocol
Representative Results
Discussion
HORC est actuellement le modèle le plus traduisible cliniquement dans la recherche rétinienne préclinique. Par rapport aux modèles de culture cellulaire in vitro, HORC peut mieux représenter l’anatomie de la rétine humaine in situ, en conservant les types de cellules rétiniennes dynamiques et leurs connexions avec les neurones, les vascularisations et l’environnement extracellulaire19. Par rapport aux modèles animaux, les HORC sont plus avantageux dans l’étude de la physiopathologie…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les généreux donneurs de tissus oculaires et l’équipe de la New Zealand National Eye Bank pour leur soutien. Ce travail a été soutenu financièrement par des subventions de projet du Maurice and Phyllis Paykel Trust et de l’Auckland Medical Research Foundation (1117015). La direction d’IDR est soutenue par la Buchanan Charitable Foundation. La bourse de CK est fournie par le New Zealand Association of Optometrists Education and Research Fund (CC36812) et la bourse de HHL est fournie par la Buchanan Charitable Foundation.
Materials
| Disposable Biopsy Punches (5 mm) | Integra York PA Inc., USA | 21909-142 | Referred as surgical trephines in this article |
| Human Recombinant IL-1β | Peprotech, USA | 200-01B | Working concentration: 10 ng/mL |
| Human Recombinant TNF-a | Peprotech, USA | 300-01A | Working concentration: 10 ng/mL |
| DAPI (1 µg/mL) | Sigma Aldrich, Germany | #D9542 | Nuclear stain. Working dilution 1:1000 |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA | 10565018 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1× antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100× stock) |
| Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools (F.S.T) | 14028-10 | Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools (F.S.T) | 11050-10 | Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel |
| Mouse monoclonal GFAP-Cy3 | Sigma Aldrich, Germany | #C9205 | Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000. |
| Mouse monoclonal Vimentin-Cy3 | Sigma Aldrich, Germany | #C9080 | Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50. |
| Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein) | Sigma Aldrich, Germany | #11684795910 | Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution. |
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