Caracterización de una nueva técnica de cultivo de retina organotípica humana
Summary
Este estudio tiene como objetivo desarrollar un nuevo modelo de cultivo de retina organotípico humano (HORC) que evite comprometer la integridad de la retina durante el manejo del explante. Esto se logra cultivando la retina con el vítreo resbanante y el epitelio-coroides pigmentario retiniano subyacente (RPE-coroides) y esclerótica.
Abstract
Los modelos previos de cultivo organotípico de retina (HORC) humano han utilizado retinas desprendidas; sin embargo, sin el soporte estructural conferido por el epitelio-coroide pigmentario de la retina (EPR-coroides) y la esclerótica, la integridad de la retina frágil puede verse fácilmente comprometida. El objetivo de este estudio fue desarrollar un nuevo modelo HORC que contenga la retina, la CORoides RPE y la esclerótica para mantener la integridad de la retina al cultivar explantes retinianas.
Después de cortar circunferencialmente a lo largo del limbo para eliminar el iris y el cristalino, se hicieron cuatro incisiones profundas para aplanar el ocular. A diferencia de los protocolos HORC anteriores, se utilizó una trefina para cortar no solo la retina, sino también la COROIDES y la esclerótica. Los explantes de triple capa resultantes se cultivaron durante 72 h. La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) se utilizó para evaluar las estructuras anatómicas y los explantes retinianas se caracterizaron además por inmunohistoquímica (IHC) para la apoptosis, la integridad de las células de Müller y la inflamación de la retina. Para confirmar la posibilidad de inducción de la enfermedad, los explantes fueron expuestos a glucosa alta (HG) y citoquinas proinflamatorias (Cyt), para imitar la retinopatía diabética (RD). El ensayo de perla magnética de Luminex se utilizó para medir las citoquinas relacionadas con DR liberadas en el medio de cultivo.
La tinción de H&E reveló distintas láminas retinianas y núcleos compactos en explantes retinianas con la coroides y la esclerótica subyacentes, mientras que las retinas sin las estructuras subyacentes exhibieron un grosor reducido y una pérdida severa de núcleos. Los resultados de la IHC indicaron la ausencia de apoptosis e inflamación de la retina, así como la preservación de la integridad de las células de Müller. Los ensayos de Luminex mostraron un aumento significativo de la secreción de citoquinas proinflamatorias asociadas a DR en explantes retinianas expuestos a HG + Cyt en relación con los niveles basales a las 24 h.
Desarrollamos y caracterizamos con éxito un nuevo protocolo HORC en el que se preservó la integridad de la retina sin apoptosis ni inflamación de la retina. Además, la secreción inducida de biomarcadores proinflamatorios asociados a la RD al exponer los explantes de retina a HG + Cyt sugiere que este modelo podría usarse para estudios de enfermedad de la retina clínicamente traducibles.
Introduction
La retina es una estructura ocular altamente especializada responsable de transformar la energía de la luz entrante en señales eléctricas, que luego son procesadas por el cerebro para la percepción visual. La retina humana contiene un rango dinámico de tipos de células, altamente organizadas en una estructura lamelar única que consiste en dos capas sinápticas y tres núcleos1 (Figura 1). La homeostasis retiniana se sustenta en las intrincadas conexiones entre las células neurorretinianas, los vasos sanguíneos, los nervios, los tejidos conectivos y el RPE1. Debido a la sofisticada anatomía y fisiología de la retina, los mecanismos de muchas enfermedades de la retina siguen siendo poco conocidos2,3,4,5. Para estudiar mejor las enfermedades de la retina, se han desarrollado modelos HORC6,7,8,9. En comparación con los estudios en animales y los cultivos in vitro, los modelos HORC son ventajosos porque conservan el entorno celular dinámico y las interacciones neurovasculares complejas in situ, proporcionando un buen modelo para la traducción clínica.
Figura 1: Estructuras oculares posteriores del ojo humano. De anterior a posterior, las capas de la retina son: capa de fibra nerviosa (NFL), capa de células ganglionares (GCL), capa plexiforme interna (IPL), capa nuclear interna (INL), capa plexiforme externa (OPL), capa nuclear externa (ONL), segmento interno del fotorreceptor (IS) y capa externa (SO) del fotorreceptor. Las células dentro de la retina incluyen células ganglionares (azul), células amacrinas (amarillas), células bipolares (rojas), células horizontales (púrpura), fotorreceptores de bastón (rosa) y fotorreceptores de cono (verde). El vítreo se localiza antes de la retina. El RPE, la membrana de Bruch, la coroides y la esclerótica se encuentran posteriores a la retina. Tenga en cuenta que la imagen que se muestra es solo una representación esquemática de la retina y la relación entre las células y la conectividad retiniana dentro de cada capa puede no ser indicativa de la configuración in vivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los protocolos HORC previamente caracterizados6,7,8,9 han implicado separar la retina de la RPE-coroides subyacente y la esclerótica mediante una trefina quirúrgica. Sin embargo, sin el apoyo proporcionado por estas estructuras subyacentes, la retina translúcida se vuelve endeble, difícil de manejar y herramientas como los fórceps pueden interrumpir fácilmente su integridad. Además, se ha demostrado que el aislamiento de retina en cultivo sin el RPE causa apoptosis de células ganglionares y degeneración fotorreceptora10,11,12. Por lo tanto, sería útil un protocolo HORC alternativo que minimice la pérdida de integridad de la retina e imite mejor el entorno in vivo. Esto es particularmente importante cuando se estudian los mecanismos de la enfermedad de la retina, ya que la lesión física durante el manejo del explante podría introducir artefactos. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue desarrollar un nuevo modelo HORC que incluya la RPE-coroides y la esclerótica para proteger la integridad de la retina durante el manejo y cultivo del explante.
Para lograr este objetivo, se extrajeron explantes de retina “intercalados” entre el vítreo residual y la coroides y esclerótica subyacentes. En los explantes sándwich, el vítreo pesa sobre la retina para evitar el desprendimiento y plegamiento de la retina, mientras que la esclerótica fibrosa y resistente actúa como un andamio para el soporte estructural y un punto de contacto para los pórceps. Por otra parte, modelos animales han demostrado que retener el RPE en cultivo puede prevenir la degeneración retiniana y la proliferación glial, una respuesta de las células de Müller a señales de peligro como la hipoxia y la inflamación10,11,12.
Para caracterizar el modelo, se tiñeron explantes retinianas sándwich con hematoxilina y eosina (H&E) para evaluar las estructuras anatómicas y se realizó inmunohistoquímica (IHC), marcando explantes con desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP nick end labeling (TUNEL, un marcador de células apoptóticas), proteína ácida fibrilar glial (GFAP, una inflamación retiniana y marcador de activación celular de Müller) y vimentina, un marcador de integridad celular de Müller. Para determinar si este modelo puede ser inducido a desarrollar signos moleculares de enfermedad, los explantes fueron expuestos a glucosa alta (HG) con citoquinas proinflamatorias (Cyt), interleucina-1β (IL-1β) y factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), un ambiente de cultivo que se ha demostrado que imita la retinopatía diabética (DR) tanto en modelos de enfermedades celulares como animales13,14,15. Los ensayos de Luminex se utilizaron en el modelo DR para medir las citoquinas liberadas en el medio de cultivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
HORC es actualmente el modelo clínicamente más traducible en la investigación preclínica de la retina. En comparación con los modelos de cultivo celular in vitro, HORC puede representar mejor la anatomía de la retina humana in situ, a través de la retención de los tipos dinámicos de células retinianas y sus conexiones con las neuronas, las vasculaturas y el entorno extracelular19. En comparación con los modelos animales, los HORC son más ventajosos en el estudio de la fisiopatología y…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a los generosos donantes de tejidos oculares y al equipo del Banco Nacional de Ojos de Nueva Zelanda por su apoyo. Este trabajo fue apoyado financieramente por subvenciones para proyectos del Maurice and Phyllis Paykel Trust y la Auckland Medical Research Foundation (1117015). La dirección de IDR cuenta con el apoyo de la Buchanan Charitable Foundation. La beca de CK es proporcionada por el Fondo de Educación e Investigación de la Asociación de Optometristas de Nueva Zelanda (CC36812) y la beca de HHL es proporcionada por la Fundación Caritativa Buchanan.
Materials
| Disposable Biopsy Punches (5 mm) | Integra York PA Inc., USA | 21909-142 | Referred as surgical trephines in this article |
| Human Recombinant IL-1β | Peprotech, USA | 200-01B | Working concentration: 10 ng/mL |
| Human Recombinant TNF-a | Peprotech, USA | 300-01A | Working concentration: 10 ng/mL |
| DAPI (1 µg/mL) | Sigma Aldrich, Germany | #D9542 | Nuclear stain. Working dilution 1:1000 |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA | 10565018 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1× antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100× stock) |
| Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools (F.S.T) | 14028-10 | Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools (F.S.T) | 11050-10 | Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel |
| Mouse monoclonal GFAP-Cy3 | Sigma Aldrich, Germany | #C9205 | Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000. |
| Mouse monoclonal Vimentin-Cy3 | Sigma Aldrich, Germany | #C9080 | Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50. |
| Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein) | Sigma Aldrich, Germany | #11684795910 | Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution. |
References
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Facts and Figures Concerning the Human Retina. Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , (2005).
- Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment. Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).
- Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina. Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).
- Chen, S. -. Y., et al. Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan. Biomedicine. 6 (2), (2016).
- Kaaja, R., Loukovaara, S. Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy. Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).
- Azizzadeh Pormehr, L., et al. Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).
- Fernandez-Bueno, I., et al. Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina. Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).
- Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. C., Sanderson, J. The development of human organotypic retinal cultures (HORCs) to study retinal neurodegeneration. British Journal of Ophthalmology. 95 (5), 720-726 (2011).
- Osborne, A., Hopes, M., Wright, P., Broadway, D. C., Sanderson, J. Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration. Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).
- Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture. Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).
- Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 47-58 (2008).
- Liu, L., Cheng, S. -. H., Jiang, L. -. Z., Hansmann, G., Layer, P. G. The pigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro. Experimental Eye Research. 46 (5), 801-812 (1988).
- Kuo, C., Green, C. R., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown. Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).
- Mugisho, O. O., et al. The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).
- Mugisho, O. O., et al. Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy. PLoS ONE. 13 (8), 0202156 (2018).
- . R&D Systems, I Available from: https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex (2020)
- Nakazawa, T., et al. Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).
- Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. Müller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).
- Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
- Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy. Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).
- Lee, J. -. H., et al. Cytokine profile of peripheral blood in type 2 diabetes mellitus patients with diabetic retinopathy. Annals of Clinical & Laboratory Science. 38 (4), 361-367 (2008).
- Chorostowska-Wynimko, J., et al. In vitro angiomodulatory activity of sera from type 2 diabetic patients with background retinopathy. Journal of Physiology and Pharmacology: An Official Journal of the Polish Physiological Society. 56, 65-70 (2005).
- Khalifa, R. A., Khalef, N., Moemen, L. A., Labib, H. M. The role interleukin 12 (IL-12), interferon-inducible protein 10 (IP-10) and Interleukin 18 (IL-18) in the angiogenic activity of diabetic retinopathy. Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 4, 510-514 (2009).
- Zhou, J., Wang, S., Xia, X. Role of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy. Current Eye Research. 37 (5), 416-420 (2012).
- Song, Z., et al. Increased intravitreous interleukin-18 correlated to vascular endothelial growth factor in patients with active proliferative diabetic retinopathy. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (8), 1229-1234 (2014).
- Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. , (2020).
