Caracterização de uma nova técnica de cultura de retina organotipípica humana

Summary

Este estudo tem como objetivo desenvolver um novo modelo de cultura de retina organotípica humana (HORC) que previne comprometer a integridade da retina durante o manuseio da explant. Isso é conseguido através da cultura da retina com o vítreo sobrelada e o pigmento de retina subjacente epitélio-coroide (RPE-choroid) e esclera.

Abstract

Modelos anteriores de cultura de retina organotípica humana (HORC) utilizaram retinas descoladas; no entanto, sem o suporte estrutural conferido pelo pigmento da retina epitélio-coroide (RPE-choroid) e esclera, a integridade da frágil retina pode ser facilmente comprometida. O objetivo deste estudo foi desenvolver um novo modelo HORC que contenha a retina, RPE-choroid e esclera para manter a integridade da retina ao esculpir explants da retina.

Depois de cortar circunferencialmente ao longo do limbus para remover íris e lente, quatro incisões profundas foram feitas para achatar a xícara ocular. Em contraste com os protocolos HORC anteriores, uma trefina foi usada para cortar não apenas a retina, mas também o RPE-coroid e esclera. As explantas de três camadas resultantes foram cultivadas por 72 h. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) foi utilizada para avaliar estruturas anatômicas e as explanações da retina foram ainda caracterizadas pela imunohistoquímica (IHC) para apoptose, integridade celular de Müller e inflamação da retina. Para confirmar a possibilidade de indução da doença, explantas foram expostas a citocinas pró-inflamatórias (Cyt), para imitar a retinopatia diabética (DR). O ensaio de contas magnéticas Luminex foi usado para medir citocinas relacionadas à DR liberadas no meio da cultura.

A coloração de H&E revelou lamellae de retina distinta e núcleos compactos em explantas de retina com o RPE-coroide e esclera subjacentes, enquanto as retinas sem as estruturas subjacentes apresentaram espessura reduzida e perda severa de núcleos. Os resultados do IHC indicaram ausência de apoptose e inflamação da retina, bem como a integridade celular de Müller preservada. Os ensaios luminex mostraram significativamente aumentado a secreção de citocinas pró-inflamatórias associadas à DR em explantas de retina expostas a HG + Cyt em relação aos níveis de linha de base a 24 h.

Desenvolvemos e caracterizamos com sucesso um novo protocolo HORC no qual a integridade da retina foi preservada sem apoptose ou inflamação da retina. Além disso, a secreção induzida de biomarcadores pró-inflamatórios associados à DR ao expor explantas de retina ao HG + Cyt sugere que este modelo poderia ser usado para estudos clinicamente traduzíveis da doença da retina.

Introduction

A retina é uma estrutura ocular altamente especializada responsável por transformar energia leve de entrada em sinais elétricos, que são então processados pelo cérebro para percepção visual. A retina humana contém uma gama dinâmica de tipos celulares, altamente organizada em uma estrutura lamelar única composta por duas camadas sinápticas e três núcleos¹ (Figura 1). A homeostase da retina é sustentada pelas intrincadas conexões entre células neuroretinais, vasos sanguíneos, nervos, tecidos conjuntivos e o RPE¹. Devido à sofisticada anatomia e fisiologia da retina, os mecanismos de muitas doenças da retina ainda permanecem mal compreendidos^2,3,4,5. Para melhor estudar as doenças da retina, foram desenvolvidos modelos HORC^6,7,8,9. Em comparação com estudos em animais e culturas in vitro, os modelos HORC são vantajosos porque mantêm o ambiente celular dinâmico e interações neurovasculares complexas in situ, proporcionando um bom modelo para tradução clínica.

Figura 1: Estruturas oculares posteriores do olho humano. Anterior a posterior, as camadas de retina são: camada de fibra nervosa (NFL), camada de célula de glion (GCL), camada plexiforme interna (IPL), camada nuclear interna (INL), camada plexiforme externa (OPL), camada nuclear externa (ONL), segmento interno do fotoreceptor (IS) e camada externa fotorreceptora (OS). As células dentro da retina incluem células de gânglio (azul), células amacrinas (amarelas), células bipolares (vermelhas), células horizontais (roxas), fotorreceptores de vara (rosa) e fotorreceptores de cone (verde). O vítreo está localizado anterior à retina. O RPE, a membrana de Bruch, coroide e esclera estão localizados posteriormente à retina. Observe que a imagem mostrada é apenas uma representação esquemática da retina e a razão de conectividade celular/retina dentro de cada camada pode não ser indicativa do cenário in vivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os protocolos HORC anteriormente caracterizados^6,7,8,9 envolveram a separação da retina do RPE-coroide e esclera subjacentes utilizando uma trefina cirúrgica. No entanto, sem o suporte fornecido por essas estruturas subjacentes, a retina translúcida torna-se frágil, difícil de manusear e ferramentas como fórceps podem facilmente interromper sua integridade. Além disso, isolar a retina na cultura sem o RPE tem sido demonstrada como causa de apoptose de células gânglios e degeneração fotorreceptora^10,11,12. Assim, um protocolo HORC alternativo que minimize a perda da integridade da retina e imite melhor o ambiente in vivo seria útil. Isso é particularmente importante ao estudar mecanismos de doenças da retina, pois lesões físicas durante o manuseio de explant podem introduzir artefatos. Por isso, o objetivo deste estudo foi desenvolver um novo modelo HORC que inclua o RPE-choroid e a esclera, a fim de proteger a integridade da retina durante o manuseio e cultura da explant.

Para atingir esse objetivo, foram extraídas explanações de retina “sanduíche” entre o vítreo residual e o RPE-coroide e esclera subjacentes. Nas explantas do sanduíche, o vítreo pesa para baixo da retina para evitar o descolamento e a dobra da retina, enquanto a esclera resistente e fibrosa atua tanto como um andaime para suporte estrutural quanto um ponto de contato para fórceps. Além disso, modelos animais têm demonstrado que a retenção do RPE na cultura pode prevenir a degeneração da retina e a proliferação gliana, uma resposta das células de Müller a sinais de perigo como hipóxia e inflamação^10,11,12.

Para caracterizar o modelo, foram realizadas explanações de retina sanduíche com Hemaoxilalina e Eosina (H&E) para avaliar estruturas anatômicas e imunohistoquímica (IHC), rotulagem explants com terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL, um marcador de célula apoptótica), proteína ácida fibrilar gliana (GFAP, uma inflamação da retina e marcador de ativação celular Müller), e vimentina, um marcador de integridade celular Müller. Para determinar se esse modelo pode ser induzido a desenvolver sinais de doença molecular, as explantas foram expostas à alta glicose (HG) com citocinas pró-inflamatórias (Cyt), interleucina-1β (IL-1β) e fator-α tumoral (TNF-α), ambiente de cultivo que tem sido mostrado para imitar a retinopatia diabética (DR) nos modelos de doenças celulares e animais^13,14,15. Os ensaios luminex foram utilizados no modelo DR para medir citocinas liberadas no meio da cultura.

Protocol

Os copos oculares de doadores humanos foram obtidos do Banco Nacional de Olhos da Nova Zelândia após a excisão da córnea para transplante e aprovados pelo Comitê de Ética em Saúde e Deficiência do Norte B (NTX/06/19/CPD/AM07). NOTA: A cultura deve ser feita em um armário de biossegurança classe II para garantir condições de cultura de tecido estéril. Os tecidos devem ser cultivados dentro de 24 horas após a morte para evitar perda significativa de integridade da retina. <p cl…

Representative Results

A integridade da retina foi preservada neste modelo HORC. A integridade da retina foi preservada nas explantas de retina de sanduíches cultivados, mas foi perdida na retina cultivada sem estruturas adjacentes. A H&E foi conduzida para examinar a integridade estrutural das explantas de retina de sanduíche seccionada após 72 h na cultura. As explantas de retina do sanduíche mostraram integridade preservada e uma estrutura lamellae distinta de GCL a ONL com núcleos com…

Discussion

HORC é atualmente o modelo mais clinicamente traduzível em pesquisas pré-clínicas de retina. Em comparação com modelos de cultura celular in vitro, o HORC pode representar melhor a anatomia da retina humana in situ, através da retenção dos tipos dinâmicos de células da retina e suas conexões com neurônios, vasculaturas e o ambiente extracelular¹⁹. Em comparação com os modelos animais, o HORC é mais vantajoso no estudo da fisiopatologia e na concepção de tratamentos farmacêuticos…

Materials

Disposable Biopsy Punches (5 mm)	Integra York PA Inc., USA	21909-142	Referred as surgical trephines in this article
Human Recombinant IL-1β	Peprotech, USA	200-01B	Working concentration: 10 ng/mL
Human Recombinant  TNF-a	Peprotech, USA	300-01A	Working concentration: 10 ng/mL
DAPI (1 µg/mL)	Sigma Aldrich, Germany	#D9542	Nuclear stain. Working dilution 1:1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA	10565018	Dulbecco’s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1× antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100× stock)
Fine Scissors – Sharp-Blunt	Fine Science Tools (F.S.T)	14028-10	Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Graefe Forceps	Fine Science Tools (F.S.T)	11050-10	Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel
Mouse monoclonal GFAP-Cy3	Sigma Aldrich, Germany	#C9205	Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000.
Mouse monoclonal Vimentin-Cy3	Sigma Aldrich, Germany	#C9080	Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50.
Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein)	Sigma Aldrich, Germany	#11684795910	Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution.