新しいヒトの言語性の高いレティナル文化技術の特徴付け
Summary
本研究は、外植物の取り扱い中にレチナル完全性を損なうことを防ぐ新しいヒトの妄想性レチナルカルチャー(HORC)モデルの開発を目的としている。これは、上層の色素および下層の網膜色素上皮-脈絡膜(RPE-脈絡膜)および皮膜で網膜を培養することによって達成される。
Abstract
以前のヒトの組織性網膜培養(HORC)モデルは、剥離網膜を利用してきました。しかし、網膜色素上皮脈絡(RPE-脈絡膜)および強膜によって与えられる構造的支持能がなければ、脆弱な網膜の完全性が容易に損なわれる可能性がある。本研究の目的は、レチナの外植体を培養する際に、レチナ、RPE-脈絡膜および皮膜を含む新しいHORCモデルを開発することであった。
虹彩とレンズを取り除くために四肢に沿って周方向に切断した後、4つの深い切開部がアイカップを平らにするために作られた。以前のHORCプロトコルとは対照的に、トレフィンは、レチナだけでなく、RPE-脈絡膜およびスクレラを切断するために使用されました。得られた三重層化外植物を72時間培養した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色(H&E)は解剖学的構造を評価するために使用され、さらにアポトーシス、ミュラー細胞の完全性および経常性炎症のための免疫組織化学(IHC)によって特徴づけられた。病気の誘発の可能性を確認するために、外植体を高グルコース(HG)および炎症性サイトカイン(Cyt)に曝露し、糖尿病性網膜症(DR)を模倣した。このルミネックス磁気ビーズアッセイは、培養培地中に放出されたDR関連サイトカインを測定するために使用された。
H&E染色は、基礎となるRPE-脈絡膜および強膜を有するレチナル外植体における明確なレチナルラメラおよびコンパクト核を明らかにしたが、基礎構造を有しないレチナは厚さの減少と重度の核喪失を示した。IHCの結果は、アポトーシスおよび再発性炎症の欠如ならびに保存されたミュラー細胞の完全性を示した。Luminexアッセイは、HG+Cytに曝露されたレチナル外植体におけるDR関連の炎症促進サイトカインの分泌が24時間のベースラインレベルに対して有意に増加することを示した。
我々は、アポトーシスやレチナル炎症を伴わずにレチナル完全性を維持する新しいHORCプロトコルの開発と特徴付けに成功した。さらに、HG+Cytにレチナル外植物質を曝露する際のDR関連プロ炎症バイオマーカーの誘導分泌は、このモデルが臨床的に翻訳可能な疾患研究に使用できることを示唆している。
Introduction
レチナは、入ってくる光エネルギーを電気信号に変換する高度に特殊化された眼構造であり、その後、視覚のために脳によって処理されます。ヒトのレティナは、細胞型のダイナミックレンジを含んでおり、シナプス2層と3つの核層1からなる独特な層構造で高度に組織化されている(図1)。レチナル恒常性は、神経レチナル細胞、血管、神経、結合組織およびRPE1との間の複雑な接続によって支えられています。高度な腎解剖学と生理学のために、多くの疾患のメカニズムはまだ十分に理解されていない2,3,4,5.より良い疾患を研究するために、HORCモデルは6、7、8、9を開発しました。動物実験やインビトロ培養と比較して、HORCモデルは、動的な細胞環境と複雑な神経血管相互作用をその場で保持し、臨床翻訳のための良いモデルを提供するため有利です。
図1:人間の眼の後眼構造後部に対する前部、眼窩層は、神経線維層(NFL)、神経節細胞層(GCL)、内神経叢層(IPL)、内核層(INL)、外プレキシフォーム層(OPL)、外核層(ONL)、感光体内層(IS)、および感光体外層(OS)である。この細胞内の細胞には、神経節細胞(青)、アマクライン細胞(黄)、双極細胞(赤)、水平細胞(紫)、ロッド感光体(ピンク)および円錐感光体(緑色)が含まれる。このビトレウスは、レチナの前に位置しています。RPE、ブルッフの膜、脈絡膜および強膜は、後部に位置する。なお、画像は、retinaの概略表現であり、各層内の細胞/レチナル接続性の比率は、in vivo設定を示すものではないかもしれない。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
以前に特徴付けられるHORCプロトコル6、7、8、9は、外科トレフィンを使用して、基礎となるRPE-脈絡膜および鎖膜からレチナを分離することに関与していた。しかし、これらの基礎構造によって提供されるサポートがなければ、半透明のretinaは薄っぺらになり、取り扱いにくく、鉗子などのツールは容易にその完全性を破壊し得る。さらに、RPEを含まない培養での分離性レチナは、神経節細胞アポトーシスおよび感光体変性10、11、12を引き起こすことが示されている。したがって、retinal完全性の損失を最小限に抑え、in vivo環境をよりよく模倣する代替HORCプロトコルが有用であろう。これは、外植の取り扱い中の身体的傷害が人工物を導入する可能性があるため、疾患のメカニズムを研究する際に特に重要です。そこで本研究の目的は、外植の取り扱いと培養の際のレチナル完全性を保護するために、RPE-脈絡膜と皮膜を含む新しいHORCモデルを開発することであった。
この目的を達成するために、残留性の植物と下層のRPE-脈絡膜と皮膜の間に「挟まれた」植物の再チナリを抽出した。サンドイッチの外植では、網膜剥離と折りたたみを防ぐために網膜の重さを量るのに対し、硬い線維性強膜は構造的支持のための足場と鉗子の接触点の両方として機能する。また、動物モデルは、培養中にRPEを保持することで、残存性の変性やグリア増殖を防ぐことができる、低酸素および炎症10、11、12などの危険信号に対するミュラー細胞の応答を示している。
モデルを特徴付けるために、サンドイッチの残膜外植体をヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色し、解剖学的構造を評価し、免疫組織化学(IHC)を実施し、 末端デオキシヌクレオチジルトランスファーーゼdUTPニックエンドラベリング(TUNEL、アポトーシス細胞マーカー)、グリア性フィブリリン酸タンパク質(GFAP、眼炎およびミュラー細胞活性化マーカー)、およびミュラー細胞完全性のマーカーであるビメンチンを用いた外植体を標識する。このモデルが分子疾患の徴候を発症するように誘導できるかどうかを判断するために、外植体は、炎症促進性サイトカイン(Cyt)、インターロイキン-1β(IL-1β)および腫瘍壊死因子α(TNF-α)を有する高グルコース(HG)に曝露された。ルミネックスアッセイは、培養培地中に放出されたサイトカインを測定するためにDRモデルで使用された。
Protocol
Representative Results
Discussion
HORCは現在、前臨床の臨床前の研究で最も臨床的に翻訳可能なモデルです。in vitro細胞培養モデルと比較して、HORCは、動的なレチナル細胞タイプおよびニューロンとのそれらの接続を保持することによって、ヒトのレチナの解剖学的構造をより良く表すことができる、 血管系および細胞外環境19。動物モデルと比較してHORCは、動物モデル19の陽性結果にもか…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、眼組織の寛大なドナーとニュージーランド国立眼科銀行のチームの支援に感謝したいと考えています。この研究は、モーリス・アンド・フィリス・ペイケル・トラストとオークランド医学研究財団(1117015)からのプロジェクト助成金によって財政的に支援されました。IDRの取締役はブキャナン慈善財団の支援を受けています。CKの奨学金はニュージーランド検眼医教育研究基金(CC36812)によって提供され、HHLの奨学金はブキャナン慈善財団によって提供されています。
Materials
| Disposable Biopsy Punches (5 mm) | Integra York PA Inc., USA | 21909-142 | Referred as surgical trephines in this article |
| Human Recombinant IL-1β | Peprotech, USA | 200-01B | Working concentration: 10 ng/mL |
| Human Recombinant TNF-a | Peprotech, USA | 300-01A | Working concentration: 10 ng/mL |
| DAPI (1 µg/mL) | Sigma Aldrich, Germany | #D9542 | Nuclear stain. Working dilution 1:1000 |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA | 10565018 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1× antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100× stock) |
| Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools (F.S.T) | 14028-10 | Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools (F.S.T) | 11050-10 | Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel |
| Mouse monoclonal GFAP-Cy3 | Sigma Aldrich, Germany | #C9205 | Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000. |
| Mouse monoclonal Vimentin-Cy3 | Sigma Aldrich, Germany | #C9080 | Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50. |
| Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein) | Sigma Aldrich, Germany | #11684795910 | Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution. |
References
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Facts and Figures Concerning the Human Retina. Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , (2005).
- Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment. Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).
- Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina. Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).
- Chen, S. -. Y., et al. Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan. Biomedicine. 6 (2), (2016).
- Kaaja, R., Loukovaara, S. Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy. Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).
- Azizzadeh Pormehr, L., et al. Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).
- Fernandez-Bueno, I., et al. Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina. Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).
- Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. C., Sanderson, J. The development of human organotypic retinal cultures (HORCs) to study retinal neurodegeneration. British Journal of Ophthalmology. 95 (5), 720-726 (2011).
- Osborne, A., Hopes, M., Wright, P., Broadway, D. C., Sanderson, J. Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration. Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).
- Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture. Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).
- Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 47-58 (2008).
- Liu, L., Cheng, S. -. H., Jiang, L. -. Z., Hansmann, G., Layer, P. G. The pigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro. Experimental Eye Research. 46 (5), 801-812 (1988).
- Kuo, C., Green, C. R., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown. Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).
- Mugisho, O. O., et al. The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).
- Mugisho, O. O., et al. Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy. PLoS ONE. 13 (8), 0202156 (2018).
- . R&D Systems, I Available from: https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex (2020)
- Nakazawa, T., et al. Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).
- Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. Müller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).
- Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
- Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy. Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).
- Lee, J. -. H., et al. Cytokine profile of peripheral blood in type 2 diabetes mellitus patients with diabetic retinopathy. Annals of Clinical & Laboratory Science. 38 (4), 361-367 (2008).
- Chorostowska-Wynimko, J., et al. In vitro angiomodulatory activity of sera from type 2 diabetic patients with background retinopathy. Journal of Physiology and Pharmacology: An Official Journal of the Polish Physiological Society. 56, 65-70 (2005).
- Khalifa, R. A., Khalef, N., Moemen, L. A., Labib, H. M. The role interleukin 12 (IL-12), interferon-inducible protein 10 (IP-10) and Interleukin 18 (IL-18) in the angiogenic activity of diabetic retinopathy. Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 4, 510-514 (2009).
- Zhou, J., Wang, S., Xia, X. Role of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy. Current Eye Research. 37 (5), 416-420 (2012).
- Song, Z., et al. Increased intravitreous interleukin-18 correlated to vascular endothelial growth factor in patients with active proliferative diabetic retinopathy. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (8), 1229-1234 (2014).
- Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. , (2020).
