Karakterisering af en ny human organotypic retinal kultur teknik

Summary

Denne undersøgelse har til formål at udvikle en ny human organotypic retinal kultur (HORC) model, der forhindrer kompromittere retinal integritet under explant håndtering. Dette opnås ved at dyrke nethinden med den overliggende glaslegeme og det underliggende retinale pigment epitel-choroid (RPE-choroid) og sclera.

Abstract

Tidligere humane organotypic retinal kultur (HORC) modeller har udnyttet løsrevne nethinder; men uden den strukturelle støtte, som retinale pigment epitel-choroid (RPE-choroid) og sclera, integriteten af den skrøbelige nethinden let kan kompromitteres. Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en ny HORC model, der indeholder nethinden, RPE-choroid og sclera at opretholde retinal integritet, når dyrkning retinale explants.

Efter at have skåret omkredsligt langs limbus for at fjerne iris og linse, fire dybe snit blev foretaget for at flade øjet. I modsætning til tidligere HORC protokoller, en trephin blev brugt til at skære igennem ikke kun nethinden, men også RPE-choroid og sclera. De resulterende triple-lag explants blev kultiveret i 72 timer. Hæmatoxylin og Eosin farvning (H&E) blev brugt til at vurdere anatomiske strukturer og retinale explants var yderligere karakteriseret ved immunohistochemistry (IHC) for apoptose, Müller celle integritet og retinal betændelse. For at bekræfte muligheden for sygdom induktion, explants blev udsat for høj glukose (HG) og pro-inflammatoriske cytokiner (Cyt), at efterligne diabetisk retinopati (DR). Luminex magnetiske perle assay blev brugt til at måle DR-relaterede cytokiner frigivet i kulturmediet.

H &E farvning afslørede forskellige retinale lameller og kompakte kerner i retinale explants med den underliggende RPE-choroid og sclera, mens nethinder uden de underliggende strukturer udviste reduceret tykkelse og alvorlige kerner tab. IHC-resultater indikerede fravær af apoptose og retinal inflammation samt bevaret Müller celleintegritet. Luminex-analyserne viste signifikant øget udskillelse af DR-associerede proinflammatoriske cytokiner i retinale explants, der blev eksponeret for HG + Cyt i forhold til baselineniveauer ved 24 timer.

Vi har med succes udviklet og karakteriseret en ny HORC-protokol, hvor retinal integritet blev bevaret uden apoptose eller retinal betændelse. Desuden tyder den inducerede udskillelse af DR-associerede proinflammatoriske biomarkører, når de udsætter retinale explants for HG + Cyt, at denne model kan bruges til klinisk oversættelige retinale sygdomsundersøgelser.

Introduction

Nethinden er en højt specialiseret okulær struktur, der er ansvarlig for at omdanne indgående lysenergi til elektriske signaler, som derefter behandles af hjernen for visuel opfattelse. Den menneskelige nethinde indeholder et dynamisk område af celletyper, velorganiseret i en unik lamellar struktur bestående af to synaptiske og tre kerner lag¹ (Figur 1). Retinal homøostase opretholdes af de indviklede forbindelser mellem neuroretinale celler, blodkar, nerver, bindevæv og RPE¹. På grund af den sofistikerede retinale anatomi og fysiologi forbliver mekanismer af mange retinale sygdomme stadig dårligt forstået^2,3,4,5. For bedre at kunne studere retinale sygdomme er HORC-modeller udviklet^6,7,8,9. Sammenlignet med dyreforsøg og in vitro-kulturer er HORC-modeller fordelagtige, fordi de bevarer det dynamiske cellulære miljø og komplekse neurovaskulære interaktioner in situ, hvilket giver en god model til klinisk oversættelse.

Figur 1: Bageste okulære strukturer i det menneskelige øje. Forreste til posterior, retinale lag er: nerve fiber lag (NFL), ganglion cellelag (GCL), indre plexiform lag (IPL), indre nukleare lag (INL), ydre plexiform lag (OPL), ydre nukleare lag (ONL), fotoreceptor indre segment (IS), og photoreceptor ydre lag (OS). Celler i nethinden omfatter ganglion celler (blå), amakrine celler (gul), bipolare celler (rød), vandrette celler (lilla), stang photoreceptorer (pink) og kegle fotoreceptorer (grøn). Glaslegemet er placeret forreste til nethinden. RPE, Bruchs membran, choroid og sclera er placeret posterior til nethinden. Bemærk, at det viste billede kun er en skematisk repræsentation af nethinden, og forholdet mellem celler/retinale tilslutningsmuligheder inden for hvert lag er muligvis ikke tegn på in vivo-indstillingen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tidligere karakteriseret HORC protokoller^6,7,8,9 har involveret adskille nethinden fra den underliggende RPE-choroid og sclera ved hjælp af en kirurgisk trephin. Men uden den støtte, som disse underliggende strukturer, den gennemskinnelige nethinde bliver spinkel, vanskeligt at håndtere og værktøjer såsom sammenkramper kan nemt forstyrre dens integritet. Desuden har isolerende nethinden i kultur uden RPE vist sig at forårsage ganglion celle apoptose og fotoreceptor degeneration^10,11,12. Således ville en alternativ HORC-protokol, der minimerer tabet af retinal integritet og bedre efterligner in vivo-miljøet, være nyttig. Dette er især vigtigt, når man studerer retinale sygdomsmekanismer, da fysisk skade under explanthåndtering kan introducere artefakter. Derfor var formålet med denne undersøgelse at udvikle en ny HORC-model, der omfatter RPE-choroid og sclera for at beskytte retinal integritet under explanthåndtering og kultur.

For at nå dette mål blev retinale explants “klemt” mellem de resterende glaslegemer og den underliggende RPE-choroid og sclera ekstraheret. I sandwich explants, glaslegeme vejer ned nethinden for at forhindre nethinde løsrivelse og foldning, mens den hårde, fibrøse sclera fungerer som både et stillads for strukturel støtte og et kontaktpunkt for sammentøvler. Desuden har dyremodeller vist, at bevare RPE i kultur kan forhindre retinal degeneration og glial spredning, en reaktion af Müller celler til faresignaler såsom hypoxi og betændelse^10,11,12.

For at karakterisere modellen blev der udført sandwich retinale explants med Hematoxylin og Eosin (H&E) for at vurdere anatomiske strukturer og immunohistochemistry (IHC), mærkning af explants med terminal deoxynukleotidyl transferase dUTP nick end mærkning (TUNEL, en apoptotisk cellemarkør), glial fibrillalsyresyreprotein (GFAP, en retinal betændelse og Müller celleaktiveringsmarkør) og vimentin, en markør for Müller celleintegritet. For at afgøre, om denne model kan induceres til at udvikle molekylære sygdomstegn, blev explants udsat for høj glukose (HG) med proinflammatoriske cytokiner (Cyt), interleukin-1β (IL-1β) og tumornekrosefaktor-α (TNF-α), et kulterende miljø, der har vist sig at efterligne diabetisk retinopati (DR) i både celle- og dyresygdomsmodeller^13,14,15. Luminex-analyser blev anvendt i DR-modellen til at måle cytokiner, der blev frigivet til kulturmediet.

Protocol

Human donor øjenkopper blev opnået fra New Zealand National Eye Bank efter hornhinde excision for transplantation og som godkendt af Northern B Health and Disability Ethics Committee (NTX/06/19/CPD/AM07). BEMÆRK: Kulturen skal ske i et klasse II biosikkerhedskab for at sikre sterile vævskulturforhold. Vævene skal dyrkes inden for 24 timer post mortem for at undgå betydelige retinal integritet tab. <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/6204…

Representative Results

Retinal integritet blev bevaret i denne HORC-model. Retinal integritet blev bevaret i de kultiverede sandwich retinale explants, men gik tabt i nethinden dyrkes uden tilstødende strukturer. H &E blev gennemført for at undersøge den strukturelle integritet af sektionsopdelte sandwich retinale explants efter 72 timer i kultur. Sandwich retinal explants viste bevaret integritet og en særskilt lameller struktur fra GCL til ONL med kompakte kerner i INL og ONL (<strong cl…

Discussion

HORC er i øjeblikket den mest klinisk oversættelige model i præklinisk retinal forskning. Sammenlignet med in vitro celle kultur modeller, horc kan bedre repræsentere anatomien af den menneskelige nethinden in situ, ved at bevare de dynamiske retinale celletyper og deres forbindelser med neuroner, vasulater og ekstracellulære miljø¹⁹. Sammenlignet med dyremodeller er HORC mere fordelagtige i at studere patofysiologien af og designe farmaceutiske behandlinger for humane retinale sygdomme på …

Materials

Disposable Biopsy Punches (5 mm)	Integra York PA Inc., USA	21909-142	Referred as surgical trephines in this article
Human Recombinant IL-1β	Peprotech, USA	200-01B	Working concentration: 10 ng/mL
Human Recombinant  TNF-a	Peprotech, USA	300-01A	Working concentration: 10 ng/mL
DAPI (1 µg/mL)	Sigma Aldrich, Germany	#D9542	Nuclear stain. Working dilution 1:1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA	10565018	Dulbecco’s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1× antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100× stock)
Fine Scissors – Sharp-Blunt	Fine Science Tools (F.S.T)	14028-10	Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Graefe Forceps	Fine Science Tools (F.S.T)	11050-10	Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel
Mouse monoclonal GFAP-Cy3	Sigma Aldrich, Germany	#C9205	Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000.
Mouse monoclonal Vimentin-Cy3	Sigma Aldrich, Germany	#C9080	Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50.
Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein)	Sigma Aldrich, Germany	#11684795910	Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution.