एक उपन्यास मानव ऑर्गेनोटिपिक रेटिना संस्कृति तकनीक का लक्षण वर्णन
Summary
इस अध्ययन का उद्देश्य एक उपन्यास मानव ऑर्गेनोटिपिक रेटिना कल्चर (HORC) मॉडल विकसित करना है जो एक्सप्लांट हैंडलिंग के दौरान रेटिना अखंडता से समझौता करने से रोकता है। यह रेटिना को अंतर्निहित विट्रियस और अंतर्निहित रेटिना वर्णक एपिथेलियम-कोरॉयड (आरपीई-कोरॉयड) और स्क्लेरा के साथ प्राप्त किया जाता है।
Abstract
पिछले मानव ऑर्गेनोटिपिक रेटिना कल्चर (हॉआरसी) मॉडल ने अलग रेटिना का उपयोग किया है; हालांकि, रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम-कोरॉयड (आरपीई-कोरॉयड) और स्क्लेरा द्वारा प्रदत्त संरचनात्मक समर्थन के बिना, नाजुक रेटिना की अखंडता से आसानी से समझौता किया जा सकता है। इस अध्ययन का उद्देश्य एक उपन्यास HORC मॉडल विकसित करना था जिसमें रेटिना, आरपीई-कोरॉयड और स्क्लेरा शामिल है ताकि रेटिना के विस्तार को बनाए रखा जा सके।
आईरिस और लेंस को हटाने के लिए अंगों के साथ परिधि काटने के बाद, आंखों को समतल करने के लिए चार गहरे चीरे बनाए गए थे। पिछले हॉआरसी प्रोटोकॉल के विपरीत, न केवल रेटिना बल्कि आरपीई-कोरॉइड और स्क्लेरा के माध्यम से कटौती करने के लिए एक ट्रेफिन का उपयोग किया गया था। परिणामी ट्रिपल-स्तरित एक्सप्लांट्स को 72 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था। शारीरिक संरचनाओं का आकलन करने के लिए हेमेटॉक्सीलिन और इओसिन स्टेनिंग (एचएंडई) का उपयोग किया गया था और रेटिना एक्सप्लांट का उपयोग एपोप्टोसिस, मुलर सेल अखंडता और रेटिना सूजन के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) द्वारा आगे की विशेषता थी। रोग प्रेरण की संभावना की पुष्टि करने के लिए, मधुमेह रेटिनोपैथी (डीआर) की नकल करने के लिए उच्च ग्लूकोज (एचजी) और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स (साइटोकिन्स(साइट) के संपर्क में थे। ल्यूमिनेक्स चुंबकीय मनका परख का उपयोग संस्कृति माध्यम में जारी डीआर-संबंधित साइटोकिन्स को मापने के लिए किया गया था।
एचएंडई धुंधला अंतर्निहित आरपीई-कोरॉयड और स्क्लेरा के साथ रेटिना एक्सप्लांट में अलग रेटिना लैमेले और कॉम्पैक्ट नाभिक का पता चला, जबकि अंतर्निहित संरचनाओं के बिना रेटिना कम मोटाई और गंभीर नाभिक हानि का प्रदर्शन किया । आईएचसी के परिणामों ने एपोप्टोसिस और रेटिना सूजन के साथ-साथ संरक्षित मुलर सेल अखंडता की अनुपस्थिति का संकेत दिया। ल्यूमिनेक्स के नेक कहते हैं कि 24 एच पर बेसलाइन स्तर के सापेक्ष एचजी + साइट के संपर्क में रेटिना एक्सप्लांट में डीआर-संबद्ध समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स का स्राव काफी बढ़ गया है।
हमने सफलतापूर्वक विकसित किया और एक उपन्यास होआरसी प्रोटोकॉल की विशेषता बनाई जिसमें रेटिना अखंडता को एपोप्टोसिस या रेटिना सूजन के बिना संरक्षित किया गया था। इसके अलावा, एचजी + साइट के रेटिना एक्सप्लांट को उजागर करते समय डीआर-संबद्ध समर्थक भड़काऊ बायोमार्कर के प्रेरित स्राव से पता चलता है कि इस मॉडल का उपयोग चिकित्सकीय रूप से अनुवादयोग्य रेटिना रोग अध्ययन के लिए किया जा सकता है।
Introduction
रेटिना एक अत्यधिक विशेष नेत्र संरचना है जो आने वाली प्रकाश ऊर्जा को इलेक्ट्रिक संकेतों में बदलने के लिए जिम्मेदार है, जिसे तब दृश्य धारणा के लिए मस्तिष्क द्वारा संसाधित किया जाता है। मानव रेटिना में सेल प्रकारों की एक गतिशील श्रृंखला होती है, जो एक अद्वितीय लैमेलर संरचना में अत्यधिक संगठित होती है जिसमें दो सिनैप्टिक और तीन नाभिक परतें1 (चित्रा 1) शामिल होती हैं। रेटिना होमोस्टेसिस न्यूरोरेटिनल कोशिकाओं, रक्त वाहिकाओं, नसों, संयोजी ऊतकों और आरपीई1के बीच जटिल कनेक्शन द्वारा निरंतर है। परिष्कृत रेटिना शरीर रचना और शरीर विज्ञान के कारण, कई रेटिना रोगों के तंत्र अभी भी खराब समझ में रहते हैं2,3,4,5. रेटिना रोगों का बेहतर अध्ययनकरने के लिए, हॉआरसी मॉडल6,7,8,9विकसित किए गए हैं। पशु अध्ययन और इन विट्रो संस्कृतियों की तुलना में, HORC मॉडल लाभप्रद हैं क्योंकि वे सीटू में गतिशील सेलुलर पर्यावरण और जटिल न्यूरोवैस्कुलर इंटरैक्शन को बनाए रखते हैं, जो नैदानिक अनुवाद के लिए एक अच्छा मॉडल प्रदान करते हैं।
चित्रा 1:मानव आंखों की पीछे की नेत्र संरचनाएं। पीछे के पूर्वकाल में, रेटिना परतें हैं: तंत्रिका फाइबर परत (एनएफएल), गैंगलियन सेल लेयर (जीसीएल), इनर प्लेक्सिफॉर्म लेयर (आईपीएल), इनर न्यूक्लियर लेयर (आईएनएल), बाहरी प्लेक्सीफॉर्म लेयर (ओपीएल), बाहरी परमाणु परत (ओएनएल), फोटोरिसेप्टर इनर सेगमेंट (आईएस), और फोटोरिसेप्टर बाहरी परत (ओएस)। रेटिना के भीतर कोशिकाओं में गैंगलियन कोशिकाएं (नीली), अमैक्रिन कोशिकाएं (पीली), द्विध्रुवी कोशिकाएं (लाल), क्षैतिज कोशिकाएं (बैंगनी), रॉड फोटोरिसेप्टर (गुलाबी) और शंकु फोटोरिसेप्टर (हरा) शामिल हैं। विट्रेस रेटिना के पूर्वकाल में स्थित है। आरपीई, ब्रुच की झिल्ली, कोरॉइड और स्क्लेरा रेटिना के पीछे स्थित हैं। ध्यान दें कि दिखाया गया चित्र केवल रेटिना का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व है और प्रत्येक परत के भीतर कोशिकाओं/रेटिना कनेक्टिविटी का अनुपात वीवो सेटिंग में का संकेत नहीं हो सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
पहले विशेषता HORC प्रोटोकॉल6,7,8,9 एक सर्जिकल ट्रेफिन का उपयोग कर अंतर्निहित RPE-choroid और स्क््लीरा से रेटिना को अलग करने में शामिल है । हालांकि, इन अंतर्निहित संरचनाओं द्वारा प्रदान किए गए समर्थन के बिना, पारदर्शी रेटिना तार हो जाता है, संभालना मुश्किल हो जाता है और संदंश जैसे उपकरण आसानी से इसकी अखंडता को बाधित कर सकते हैं। इसके अलावा , आरपीई के बिना संस्कृति में रेटिना को अलग करने से गंगलियन सेल एपोप्टोसिस और फोटोरिसेप्टर डिजनरेशन10 , 11,12का कारण दिखाया गया है । इस प्रकार, एक वैकल्पिक HORC प्रोटोकॉल जो रेटिना अखंडता के नुकसान को कम करता है और वीवो वातावरण में बेहतर नकल करता है, उपयोगी होगा। रेटिना रोग तंत्र का अध्ययन करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि एक्सप्लांट हैंडलिंग के दौरान शारीरिक चोट कलाकृतियों को पेश कर सकती है। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य एक उपन्यास हॉर्क मॉडल विकसित करना था जिसमें एक्सप्लांट हैंडलिंग और संस्कृति के दौरान रेटिना अखंडता की रक्षा के लिए आरपीई-कोरॉइड और स्क््लीरा शामिल है।
इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, अवशिष्ट विट्रियस और अंतर्निहित आरपीई-कोरॉयड और स्क्लेरा के बीच रेटिना एक्सप्लांट “सैंडविच” निकाले गए थे। सैंडविच एक्सप्लांट्स में, रेटिना टुकड़ी और तह को रोकने के लिए रेटिना का वजन होता है, जबकि कठिन, रेशेदार स्क्लेरा संरचनात्मक समर्थन के लिए पाड़ और फोर्स्प के लिए एक संपर्क बिंदु दोनों के रूप में कार्य करता है। इसके अलावा, पशु मॉडलों ने दिखाया है कि संस्कृति में आरपीई को बनाए रखने से रेटिना अध: पतन और ग्लियल प्रसार को रोका जा सकता है, हाइपोक्सिया और सूजन10, 11, 12जैसे खतरे के संकेतों के लिए मुलर कोशिकाओं की प्रतिक्रिया।
मॉडल की विशेषता के लिए, सैंडविच रेटिना एक्सप्लांट्स को शारीरिक संरचनाओं और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) का आकलन करने के लिए हेमटॉक्सीलिन और ईओसिन (एचएंडई) के साथ दाग दिया गया था, टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लियोक्लियोइटोटिडिल ट्रांसफरेस डयूटीप निक एंड लेबलिंग (ट्यूनल, एक एपोप्टिक सेल मार्कर), ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी, रेटिना सूजन और म्यूलर सेल एक्टिवेशन मार्कर) के साथ लेबलिंग एक्सप्लांट्स, और विमेंटिन, म्यूलर सेल इंटीग्रिटी का एक मार्कर। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या इस मॉडल को आणविक रोग के संकेत विकसित करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है, एक्सप्लांट्स को उच्च ग्लूकोज (एचजी) के साथ प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स (साइटोकिन्स(साइट), इंटरल्यूकिन-11 (आईएल-1) और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α (टीएनएफ-α) के साथ उजागर किया गया था,जो एक खेती वातावरण है जिसे कोशिका और पशु रोग मॉडल13, 14,15दोनों में मधुमेह रेटिनोपैथी (डीआर) की नकल करने के लिए दिखाया गया है। संस्कृति माध्यम में जारी साइटोकिन्स को मापने के लिए डीआर मॉडल में ल्यूमिनेक्स परख का उपयोग किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
हॉआरसी वर्तमान में प्रीक्लिनिकल रेटिना अनुसंधान में सबसे चिकित्सकीय अनुवाद योग्य मॉडल है। इन विट्रो सेल कल्चर मॉडल की तुलना में, हॉआरसी गतिशील रेटिना सेल प्रकारों और न्यूरॉन्स, वैक्यूलेचर और बाह्य ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक आंखों के ऊतकों के उदार दानदाताओं और न्यूजीलैंड नेशनल आई बैंक की टीम को उनके समर्थन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । इस काम को मौरिस और फिलिस पेकेल ट्रस्ट और ऑकलैंड मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन (1117015) से परियोजना अनुदान द्वारा आर्थिक रूप से समर्थन दिया गया था। आईडीआर की डायरेक्टरशिप बुकानन चैरिटेबल फाउंडेशन द्वारा समर्थित है । सीके की स्कॉलरशिप न्यूजीलैंड एसोसिएशन ऑफ ऑप्टोमेट्रिस्ट्स एजुकेशन एंड रिसर्च फंड (CC36812) द्वारा प्रदान की जाती है और एचएचएल की छात्रवृत्ति बुकानन चैरिटेबल फाउंडेशन द्वारा प्रदान की जाती है ।
Materials
| Disposable Biopsy Punches (5 mm) | Integra York PA Inc., USA | 21909-142 | Referred as surgical trephines in this article |
| Human Recombinant IL-1β | Peprotech, USA | 200-01B | Working concentration: 10 ng/mL |
| Human Recombinant TNF-a | Peprotech, USA | 300-01A | Working concentration: 10 ng/mL |
| DAPI (1 µg/mL) | Sigma Aldrich, Germany | #D9542 | Nuclear stain. Working dilution 1:1000 |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA | 10565018 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1× antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100× stock) |
| Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools (F.S.T) | 14028-10 | Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools (F.S.T) | 11050-10 | Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel |
| Mouse monoclonal GFAP-Cy3 | Sigma Aldrich, Germany | #C9205 | Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000. |
| Mouse monoclonal Vimentin-Cy3 | Sigma Aldrich, Germany | #C9080 | Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50. |
| Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein) | Sigma Aldrich, Germany | #11684795910 | Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution. |
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