Summary
我们提出了一种分离和培养原代小鼠胚胎腭间充质细胞的方案，用于二维（2D）生长和伤口修复测定的延时成像。我们还提供了分析延时成像数据的方法，以确定细胞流形成和方向运动。
Abstract
腭的发育是一个动态过程，它涉及舌头旁边的双侧腭架的垂直生长，然后是舌头上方的抬高和融合。这个过程中的缺陷导致腭裂，这是一种常见的出生缺陷。最近的研究表明，腭架抬高涉及重塑过程，该过程将大陆架的方向从垂直转变为水平。腭架间充质细胞在这种动态重塑中的作用一直难以研究。基于延时成像的定量分析最近已被用于表明原代小鼠胚胎腭间充质（MEPM）细胞可以自我组织成集体运动。定量分析可以识别来自具有上颚抬高缺陷的小鼠模型的突变MEPM细胞的差异。本文描述了从E13.5胚胎中分离和培养MEPM细胞的方法 - 特别是用于延时成像 - 并确定集体运动的各种细胞属性，包括河流形成，形状排列和方向持久性的测量。它假设MEPM细胞可以作为研究腭架间充质在动态抬高过程中的作用的代理模型。这些定量方法将使颅面领域的研究人员能够评估和比较对照细胞和突变细胞的集体运动属性，这将增加对腭架抬高期间间充质重塑的理解。此外，MEPM细胞为研究集体细胞运动提供了一种罕见的间充质细胞模型。
Introduction
腭发育已被广泛研究，因为腭发育缺陷导致腭裂 - 一种常见的出生缺陷，发生在孤立的病例或数百种综合征的一部分1，2。胚胎腭的发育是一个动态过程，涉及胚胎组织的运动和融合。这个过程可以分为四个主要步骤：1）诱导腭架，2）舌头旁边的腭架垂直生长，3）舌头上方腭架的升高，以及4）中线1，3，4的腭架融合。在过去的几十年里，已经鉴定出许多小鼠突变体表现出腭裂5，6，7，8。这些模型的表征表明腭架诱导，增殖和融合步骤存在缺陷;然而，腭架抬高缺陷很少见。因此，了解腭架抬高的动态是一个有趣的研究领域。
对一些具有腭架抬高缺陷的小鼠突变体的仔细分析导致目前的模型显示，腭架的前部区域似乎向上翻转，而腭架的垂直到水平运动或"重塑"发生在上颚的中后区域1，3，4， 9，10，11。腭架的内侧边缘上皮可能启动这种重塑所需的信号传导，然后由腭架间充质驱动。最近，许多研究人员在小鼠模型中发现了腭架抬高延迟，该模型显示涉及腭架的短暂性口腔粘连12，13。间充质重塑涉及细胞的重组，以在水平方向上产生凸起，同时在垂直方向9，10，14上缩回腭架。在提出影响腭架抬高和潜在间充质重塑的几种机制中，有细胞增殖15、16、17、趋化梯度18，和细胞外基质组分19、20。出现了一个重要的问题：在Specc1l-缺陷小鼠中观察到的腭架抬高延迟是否也部分是由于腭架重塑的缺陷，并且这种重塑缺陷是否表现为原代MEPM细胞21行为的内在缺陷？
原代MEPM细胞已被用于颅面领域，涉及基因表达22，23，24，25，26，27，28，29，以及少数涉及增殖30，31和迁移25，31，32的研究，但没有用于集体细胞行为分析。在2D培养和伤口修复测定中对MEPM细胞进行延时成像，以表明MEPM细胞表现出方向运动并形成密度依赖性细胞流 - 集体运动的属性21。此外，Specc1l突变细胞形成更窄的细胞流，并显示出高度可变的细胞迁移轨迹。这种缺乏协调的运动被认为是导致Specc1l突变胚胎13，21的上颚抬高延迟的原因。因此，这些使用原代MEPM细胞的相对简单的测定可以作为研究腭架抬高期间间充质重塑的代理。本文描述了原代MEPM细胞的分离和培养，以及用于2D和伤口修复测定的延时成像和分析。
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Protocol
所有涉及动物的实验均按照KUMC机构动物护理和使用委员会批准的协议进行，符合其指南和法规（协议编号：2018-2447）。
1. 收获E13.5胚胎
- 使用CO2 吸入室或机构动物护理和使用委员会批准的程序对怀孕的雌性小鼠实施安乐死。立即进行解剖。
- 通过去除皮肤和腹膜来暴露腹腔的下半部分。切除含有E13.5胚胎的子宫的两个角。
- 将子宫短暂置于预热的37°C无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，以冲洗掉多余的血液，头发或其他碎屑。将子宫置于充满无菌PBS的无菌10厘米培养皿中。
- 使用小剪刀，沿着子宫的长度穿过子宫壁，露出每个胚胎，仍然在其卵黄囊中。去除胚胎周围的卵黄囊，但如果需要，请将其保存以进行基因分型。当胚胎被移除时，将每个胚胎放在充满PBS的12孔板中。
2. 从胚胎中解剖腭架（图1）
注意：在处理每个胚胎后，首先将器械放入100%乙醇（EtOH）的烧杯中，然后在350°C的仪器灭菌器中灭菌10秒，然后在100%EtOH的第二个烧杯中冷却它们，对不锈钢解剖器械（见 材料表）进行灭菌。
- 使用无菌穿孔的勺子，将胚胎放入装有MEPM培养基的新10厘米培养皿中，该培养基由Dulbecco的最低必需培养基（DMEM）组成，含有10%胎牛血清（FBS），L-谷氨酰胺（4mM L-Glu）以及抗生素 - 青霉素和链霉素（50单位/ mL）。
- 使用无菌剪刀将胚胎斩首至下颌线正下方（图1A，红色虚线）。通过将一点无菌的精细#5镊子插入口腔中来去除下颌，使其保持在脸颊内。将插入的镊子的尖端推入，直到它从颅骨后部流出。
- 沿着 图1B中的黄线定位镊子，使镊子的另一侧（仍在胚胎外）悬停在耳道上方，然后捏住镊子以切割组织。如有必要，沿着现已关闭的镊子的接缝处再用一根细镊子切割，以切穿任何未被捏合完全切断的组织。
- 对胚胎头部的另一侧重复上一步。继续捏切手术，完全切除下颌、舌头和颅骨的下部，并暴露腭架。
- 通过切开眼睛上方的颅骨来去除颅骨，如图1C（绿线）所示。为此，将头部放在左侧或右侧，并将小不锈钢剪刀的尖端定位在头骨的正上方，正好位于胚胎的眼睛水平上方。用剪刀快速剪断头骨的顶部，形成一个平坦的表面，这对后续步骤的稳定性非常重要，从侧面看时应该看起来像图1D。
- 将头部的剩余部分倒置，头部的上部（颅骨去除）平放在盘子的底部，这将为腭架移除提供稳定的表面。花点时间识别腭架，它们现在暴露在外并朝上，并将在头部前半部分的中央凹槽的两侧显示为两个凸起的脊（图1E）。
- 将头部的剩余部分固定在盘子上，以便在移除搁板时将其固定。为此，将细镊子的一个点插入头部前部的鼻部区域附近的组织，然后通过颅底插入镊子的另一点，后部到腭架。在进行腭架切除时将它们固定到位。
- 用一只手固定头部，首先从两个搁板中选择一个以取出，然后将第二对细镊子的两个点插入架子外侧表面底部的组织中，然后捏合以切割组织（图1F）。沿着搁板内侧表面的底部重复此操作，然后在搁板的前两端和后端重复此操作，以脱离头部。
- 轻轻抬起搁板，根据需要进行额外的捏合，以将搁板从周围组织中完全释放出来。
- 重复前两个步骤以移除第二个腭架。
- 现在，将腭架从周围组织中解放出来并放置在PBS中（图G），使用无菌塑料灯泡移液管抽出移液器中的架子，并将它们与约500μLPBS一起转移到1.5mL微量离心管中。将装有腭架的管子放在冰上，因为其余的垃圾以相同的方式处理。
注意：或者，可以在解剖后立即将搁板放置在含有预热胰蛋白酶（0.25%）的1.5mL微量离心管中（代替将其放在冰上）。样品将更新鲜，但必须注意为每个单独的样品安排所有后续步骤的时间，而不是集体处理样品。
3. MEPM细胞培养
注意：在此描述的条件下，腭上皮细胞不能在第一次传代中存活，导致纯腭间充质细胞培养。使用无菌技术在组织培养罩中执行所有步骤。
- 从 1.5 mL 离心管中吸出并丢弃 PBS，注意不要在此过程中丢弃搁板。立即向每个含有腭架的试管中加入200μL预热（37°C）胰蛋白酶（0.25%）。使用1000μL移液器吸头在胰蛋白酶中短暂地上下移液，以加速胰蛋白酶化。
- 将试管在37°C下孵育5分钟，然后再次上下移液每个样品以帮助分解组织。将管子在37°C下再孵育5分钟，并再次上下移液以完成组织的解离。
注意：货架必须完全或几乎完全解离并悬浮在胰蛋白酶中，没有可见的组织块残留。 - 向每个1.5mL管中加入800μLMEPM培养基（步骤2.1）。将1.5mL管以200×g离心5分钟以沉淀细胞。 除去上清液，并将细胞沉淀重悬于1mL MEPM培养基中。
- 将MEPM细胞接种到含有MEPM培养基的6孔组织培养皿中。让细胞在37°C下在具有5%CO 2的培养箱中粘附在塑料表面上12小时。
注意：孵育过夜后，绝大多数（约90%）细胞将附着。此时，粘附的细胞看起来相当均匀，具有三角形或略微细长的形状。 - 每天更换培养基，轻轻吸出旧培养基，并立即用1毫升不含钙或镁的温热无菌PBS代替约1分钟。吸出PBS，并用3 mL预热MEPM培养基代替。
- 一旦细胞100%汇合，就传代细胞。
注意：MEPM细胞应该通过几乎每天增加一倍的数量来增殖。- 为了通过细胞，轻轻吸出旧培养基，并立即用不含钙或镁的温PBS替换它约1分钟。抽吸PBS，并用0.5 mL预热的0.25%胰蛋白酶代替。
- 在37°C下孵育约5分钟，或直到细胞在用手轻轻来回摇摆时从培养皿表面脱落。一旦细胞分离，立即向胰蛋白酶消化的细胞中加入5mL预热MEPM培养基。
- 使用10mL血清学移液器，将细胞轻轻收集在15mL锥形管中，并以200×g离心管5分钟以沉淀细胞。 吸出胰蛋白酶和培养基，并将细胞重悬于3mL预热MEPM培养基中。将1mL细胞轻轻移入6孔培养皿的单孔中，并加入2mL MEPM培养基以使总体积达到3mL。
注意：这构成了1：3的单元格分割。MEPM 最多可通过三次。MEPM的接种密度有些灵活，并且存在的细胞数量因培养容器而异。然而，当分裂得太稀疏时，MEPM不会适当地增殖，一旦它们粘附，它们应该在新培养皿中至少融合20-25%。
4. MEPM细胞的冷冻保存
- 一旦胰蛋白酶消化的MEPM细胞沉淀，将细胞重悬于MEPM培养基中，以获得〜1×106 个细胞/ mL的浓度。将细胞移液成冷冻管，并在细胞储备中加入终浓度为5%的二甲基亚砜。盖上冷冻室，倒置短暂混合，并立即将小瓶置于以1°C / min的速度冷却的冷冻容器中。
- 将冷却器置于-80°C冰箱中过夜。第二天，将冷冻管移至液氮罐中长期储存。
- 解冻冷冻保存的MEPM细胞
- 从液氮罐中取出冷冻管，并在室温下解冻，直到内容物开始变成液体。将内容物倒入含有9 mL预热MEPM培养基的15 mL锥形管中。
- 以200×g离心管以沉淀细胞。 将细胞重悬于1mL MEPM培养基中，并将细胞移液到6孔板的单个孔中。加入2 mL温热的MEPM培养基，使总体积达到3 mL。
- 在具有5%CO2的培养箱中将细胞在37°C下培养。每天更换介质。
5. MEPM细胞的活体成像 - 2D集体迁移测定（图2）
- 准备用于实时成像的板。
- 使用小型手术剪刀或锋利的手术刀将无菌的2孔硅胶插入物缩短至约1毫米的高度。为正在使用的每种样品准备一份插入物。
- 使用镊子将缩短的2孔硅胶嵌件放在6孔板孔的中心。沿所有边缘向下按压，以确保其完全粘附。
- 按照本方案第4.3节中的步骤解冻冷冻保存的细胞。计数MEPM细胞，并在每孔40-50μL MEPM培养基的总体积中接种300个细胞/ mm2 的缩短的有机硅插入物。将细胞在37°C下在具有5%CO2的培养箱中培养过夜。
- 第二天，准备进行实时延时成像。
- 使用具有舞台培养箱和自动成像功能的相差显微镜。向舞台培养箱储液器中加入水，以减少培养基的蒸发;将温度设置为 37 °C，将 CO2 设置为 5%。在将6孔培养皿放入舞台培养箱之前，留出约30分钟以使湿度积聚。
- 使用与以下等效的设置进行延时成像。
- 选择具有大视场和相差滤光片的 4x 物镜。
注：通常不需要自动对焦、自动查找样张、Z轴堆栈和自动照明。 - 每孔选择两个微观场，以捕获缩短的硅胶嵌件的腔。确保所有成像位置都有正确的焦点。
注：图像平面可以在成像过程中进行调整，但通常不需要进行此类调整。 - 选择所需的图像输出文件类型，然后根据需要选择或取消选择成像后选项，例如自动视频创建和水印。如果适用，请选择相差作为成像模式。
注意：使用水印可能会妨碍后续的图像处理步骤。 - 将录制的持续时间设置为 72 小时。将程序设置为每10分钟捕获一次图像。
注意：通常只需要48小时的成像，但成像可以在72小时标记之前的任何时间点停止，而不会丢失已经拍摄的图像。 - 确保环境箱按照5.3.1的要求运行。保存这些设置（例程）并开始映像。
- 选择具有大视场和相差滤光片的 4x 物镜。
- 继续成像直到72小时（或指定的时间）。
6. 在伤口修复测定中MEPM细胞的活体成像（图3）
- 准备用于实时成像的板。使用镊子，将无菌的2孔硅胶嵌件放在6孔板孔的中心，并沿着所有边缘向下按压以确保其完全粘附。为正在使用的每种样品准备一个2孔插入物。
- 按照本方案第4.3节中的步骤解冻冷冻保存的细胞。计数MEPM细胞，并在必要时将细胞浓缩至至少350个细胞/ μL。
- 将1400个细胞/ mm2接种到硅胶插入物中，每孔体积为100μLMEPM培养基。将细胞在37°C下在5%CO2的培养箱中培养48小时，并每天更换培养基。
- 48小时后，准备显微镜进行实时延时成像，如第5.3和5.4节所述。在将细胞放入舞台培养箱之前，立即向孔中（但在插入物之外）加入3mL预热的MEPM培养基，然后小心地取出硅胶插入物。
注意：分隔2个腔室的墙壁留下一个间隙，即"伤口"。 - 按 5.4 中所述启动延时成像，但有以下区别：
- 使用放大倍率较高（例如 10 倍）物镜。要捕获伤口闭合，请沿每个伤口选择 5 个视场，以便伤口与图像的垂直轴平行。
- 72小时后或伤口完全闭合后停止成像。
7. 延时图像序列的计算分析
注意：在配备标准计算工具（如 python 解释器、C 编译器和 shell）的计算机上执行以下过程（请参阅 材料表）。
- 汇合度分析
注意：该程序可用于估计稀疏培养物中的细胞增殖或量化伤口闭合实验。为了检测像元占据的区域，将分割阈值应用于图像亮度的局部标准差。该代码之前已由Wu等人33 和Neufeld等人34 描述过，可在 http://github.com/aczirok/cellconfluency。- 确定图像的分割阈值。例如，要查看阈值为 4 的分段，请发出以下命令
segment.py -i 输入图像.jpg -S 4 -测试输出.jpg
然后检查输出（输出.jpg）。
注：如果阈值太低，显微照片中的背景区域将被归类为细胞覆盖。相反，如果阈值太高，则不会将单元覆盖的区域分类为此类区域。最佳阈值将两个错误保持在最低限度。 - 使用提供的 area.sh 脚本计算图像序列的汇合值，如
area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg .... > 汇合.dat
注意：在步骤 1 中验证了判别阈值 4，并将结果存储在文件 汇合.dat中。通过将图像分类到适当的文件夹中，图像文件名列表可以替换为 通配符 表示法：
area.sh -S4 *.jpg > 汇合.dat - 对于伤口闭合实验，将汇合数据 A（t）- 以百分比表示的细胞覆盖面积的大小作为时间进入伤口边缘传播速度 V 的函数
其中 w 表示场的宽度，dA/dt 表示 A（t） 的时间导数，即单元覆盖区域的膨胀率。
- 确定图像的分割阈值。例如，要查看阈值为 4 的分段，请发出以下命令
- 细胞运动图谱
- 执行粒子图像测速（PIV）算法来表征细胞运动，并提取图像对之间局部运动"光流"的程度，但不识别单个细胞。
注：这里使用的初始窗口尺寸为50μm，如Zamir等人35 和Czirok等人36详细描述的那样，初始窗口尺寸为50μm。PIV 分析为每个图像帧 t 和位置（在图像内）x 生成一个速度场 v（x，t）。 - 从v（x，t）中提取细胞运动的平均速度，作为在细胞占用面积上计算的空间平均值，如第7.1节所述。
- 执行粒子图像测速（PIV）算法来表征细胞运动，并提取图像对之间局部运动"光流"的程度，但不识别单个细胞。
- 手动细胞追踪
注意：虽然PIV分析提供了细胞运动的自动评估，但要关注单个细胞的行为通常需要手动跟踪。虽然有几个工具提供了此功能，但如果可以在初始放置标记后修改手动定位的标记，并且可以在时间上向前和向后执行跟踪，这将非常有用。- 使用自定义开发的 python 工具 （http://github.com/donnagreta/cm_track） 执行像元追踪，该工具还提供基本的编辑器功能，例如删除轨迹段。
注意：此手动跟踪工具在文本文件中生成单元格 i 在时间 t 的位置 P（i，t），并作为调用
cm_track.py -i 图像/ -o 轨道.dat
其中延时图像位于文件夹图像中/，位置数据在文件轨道中收集.dat（图4）。
- 使用自定义开发的 python 工具 （http://github.com/donnagreta/cm_track） 执行像元追踪，该工具还提供基本的编辑器功能，例如删除轨迹段。
图4：单个细胞轨迹的分析（A）相差延时显微照片经过（B，C）手动跟踪程序，标记细胞（绿点）。（D） 每个像元的像元位置 （x，y） 被存储，每个像元的 ID 和每帧 f.（E）轨迹可以叠加在显微照片上并用颜色编码以指示时间信息。例如，在每个轨迹中，蓝色到红色调色板指示逐渐较晚的轨迹段，红色和蓝色分别标记初始和最终像元位置。（F）轨迹的各种统计性质，例如均方位移，可以提取并用于表征各种细胞群的运动性，在本例中包括野生型（wt，蓝色）和敲低（kd，红色）MEPM细胞。比例尺代表100 μm。请单击此处查看此图的放大版本。
- 使用第二个工具在图像上叠加轨迹，调用方式为
visdat.py -d 轨道.dat -i 图像/ -o 叠加/ -l999 -r3 -C2 - 收集轨迹叠加在文件夹叠加层中的图像。
注意：在此示例中，单元格位置数据存储在文件 轨道.dat中，而延时图像序列存储在文件夹图像中。其余参数控制绘制轨迹的最大长度 （-l）、符号的大小 （-r） 以及使用的配色方案 （-C）。
- 分析单个细胞轨迹
- 通过总路径长度表征轨迹
,
和朝向伤口的净位移
,
其中X表示P在垂直于伤口的方向上的投影：当伤口平行于y轴时位置的x坐标。 - 计算
每个单元i和时间点 t 37的引导效率。通过这些单细胞测量的群体平均值来表征培养物，并在合适的时间点t进行评估。
- 通过总路径长度表征轨迹
- 细胞的集体流运动
- 通过移动细胞附近的其他细胞的平均速度来表征细胞运动的局部空间相关性，如前所述38，39。
注：计算代码 https://github.com/aczirok/flowfield。- 将参考系统与每个矢量v（x，t）的前，后，左和右方向对齐（图5A）。将每个周围的单元或PIV速度矢量分配给参考系统的相应空间单元（图5B）。当每个向量作为参考系统的原点时，重复这个过程（图5C，D），以便将给定的速度向量分配给多个箱体。
注意：数据点可以位于一个向量的前面，也可以位于另一个向量的左侧。 - 将参考系统旋转到一个共同的方向（图5C，F）并将它们合并（图5G）。
注意：合并速度数据的每个箱的平均值是一个速度矢量（U），它指示空间相关性：平均值是共享速度分量的度量（图5H）。 - 用指数函数拟合U（x）流场
，其中a、x0和U0是拟合参数。在三个拟合参数中，将重点放在x0上，即相关长度（图5I，J），这是局部速度 - 速度相关性消失的特征距离。
- 将参考系统与每个矢量v（x，t）的前，后，左和右方向对齐（图5A）。将每个周围的单元或PIV速度矢量分配给参考系统的相应空间单元（图5B）。当每个向量作为参考系统的原点时，重复这个过程（图5C，D），以便将给定的速度向量分配给多个箱体。
- 通过移动细胞附近的其他细胞的平均速度来表征细胞运动的局部空间相关性，如前所述38，39。
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每个单元i和时间点 t 37的引导效率。通过这些单细胞测量的群体平均值来表征培养物，并在合适的时间点t进行评估。
，其中a、x0和U0是拟合参数。在三个拟合参数中，将重点放在x0上，即相关长度（图5I，J），这是局部速度 - 速度相关性消失的特征距离。
图5：培养细胞的流形成的表征（A，D）图4A中的相差延时图像用于识别细胞运动。对于每个移动的像元，参考系（蓝色）和空间箱（白色）被共同对齐，以将相邻像元分类为位于前方、后方、左侧或右侧。（B，E）相邻细胞（黑色向量）的速度与同一参考系（C，F）有关。对每个单元格和时间点重复此过程。（G） 在汇集这些局部信息后，每个箱子将包含多个速度矢量（灰色），可以对这些矢量进行平均，以确定相对于平均运动单元的不同位置的平均共移速度（洋红色箭头）。（H）因此，平均速度图表征了相对于移动细胞的不同位置的典型细胞速度。（I，J）最后，沿前后（平行）轴以及沿左右（垂直）轴对该场进行采样。请点击此处查看此图的放大版本。
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Representative Results
腭架的解剖如图1所示。切口的顺序旨在最大限度地减少组织的滑移。在取下头部（图1A，B）后，下颚被移除（图1B，C）。头部上部（图1C，D）的切口是用来稳定倒置时的组织（图1E）以可视化（图1E，虚线），捏（图1F）和切除（图1G）腭架。
从单个胚胎中切除的腭架对胰蛋白酶消化并在35mm培养皿或6孔培养皿的孔中培养。较大的培养皿不是首选，因为细胞密度太低，无法实现最佳生长。汇合后，来自每个孔的细胞被胰蛋白酶消化并传代到三个35-mm等效孔中（传代#1）。然后，来自传代#1的汇合细胞可以冷冻成1×106 个细胞/ mL的等分试样。随后将冷冻的等分试样放在35毫米当量的培养皿中并生长以汇合。然后将细胞胰蛋白酶消化（传代#2）并根据实验接种。创建和使用冷冻等分试样有助于使条件正常化，特别是在细胞密度方面。在实验中，使用新鲜的MEPM细胞导致最终细胞密度的更大变异性，这被认为是由于新鲜培养物中活细胞或亚活细胞比例可变。此外，这些实验的MEPM细胞传代次数严格限制为两个（上面列出）。
考虑到a）细胞密度至关重要，b）来自单个胚胎的MEPM细胞受到限制，c）成像光学在大培养皿中更好，使用2孔硅胶插入物（图2和图3）。对于伤口修复测定，MEPM细胞在2孔硅胶插入物中生长，直到高汇合，然后取出插入物，并将伤口成像直至闭合（图3）。然而，对于2D培养，MEPM细胞在生长过程中需要成像，因此只需将2孔硅胶插入物修剪到其高度的1/3rd，即可进行清晰的成像（图2C）。35 mm培养皿中的40个小3D打印环也用于2D运动分析（图2D）。
MEPM轨迹（图4E）是持久的：细胞运动的方向维持数小时。平均位移与时间的关系分析（图4F）表示位移形式的持久性与经过的时间成正比。MEPM细胞在组织培养塑料表面上的典型速度为10μm/h，也可用于细胞培养的质量控制。对运动数据的流动分析表明，MEPM细胞的共移动簇大小约为300μm（图5I，J）。代表性结果还表明野生型MEPM细胞和突变MEPM细胞之间存在深刻的运动差异。除了野生型和突变体比较外，2D和伤口修复测定还可以与各种生化治疗相结合。例如，PI3K-AKT通路激活剂已与MEPM细胞一起使用，如前所述21。
图1：解剖胚胎腭架以分离间充质细胞（A）通过沿着颈部切割（红线）去除E13.5小鼠胚胎头。（B） 接下来，用切口沿着口腔，在上下颌之间（黄线）切除下颌和舌头。（C）为了稳定组织以进行腭架移除，切除头部的顶部（绿线）。（D）将解剖的上颚区域倒置（E）以可视化腭架（黑色虚线）。（F） 单个腭架的切除被示意性地描绘，其中单个突出的架子（黄色）从上颌骨（蓝色）被捏掉。（G）从单个胚胎中切除一对腭架，然后可以胰蛋白酶消化并在35毫米培养皿或6孔板中培养。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：2D MEPM细胞培养的实验设置，解冻冷冻的MEPM细胞等分试样，（B）在35mm培养皿或6孔板中培养细胞。当汇合时，胰蛋白酶消化细胞并按照方案所述将它们接种在35毫米培养皿中，使用（C）修剪过的2孔硅胶插入物或（D）3D打印环。较小的培养空间最大限度地减少了对大量MEPM细胞的需求。修剪过的硅胶嵌件或3D打印环的薄型允许直接成像，而不会产生光晕效应。延时成像可以继续进行，直到达到所需的细胞密度，最长可达72小时。代表性图像显示在（E）0小时，（F）24小时和（G）45小时时间点。这些图像是使用4倍物镜拍摄的。E、F、G = 300 μm 的刻度标。缩写：2D = 二维;MEPM = 小鼠胚胎腭间充质;3D = 三维。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：使用MEPM细胞进行伤口闭合测定的实验设置。（A）解冻冷冻等分试样的MEPM细胞，并在35毫米培养皿或6孔板中培养细胞。当汇合时，胰蛋白酶消化细胞并（C）将它们接种在35毫米培养皿中的2孔硅胶插入物中。培养插入物中的细胞，直到达到所需的汇合（〜48小时），然后取出硅胶插入物并成像。代表性图像在取出插入件后立即显示（D），24小时后（E），40小时后显示（F）。伤口闭合大约需要36小时。这些图像是使用10倍物镜拍摄的。比例尺代表300μm。缩写：MEPM =小鼠胚胎腭间充质。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
腭架高程构成垂直到水平的重塑事件1、3、4、9、11。据推测，这种重塑过程需要腭架间充质细胞协调行为。对野生型MEPM细胞的分析表明，这种细胞行为是内在的，可以定量21。因此，这些测定可用于揭示新的和现有的腭裂小鼠模型中的原发性腭架抬高缺陷。第1节和第2节中概述的方法应允许研究人员分离，培养和冷冻原代MEPM细胞的等分试样。然后，这些细胞可用于各种应用，包括此处描述的2D培养和伤口修复测定。2D培养与延时成像相结合时，提供了一种简单的方法来确定一系列细胞密度的基本细胞属性。这里介绍的是一种评估细胞比对和细胞流形成的方法，它们是集体细胞运动的属性（图4）。伤口闭合测定通常用于评估细胞迁移41，42，43。"伤口"的无细胞区域为外围细胞的定向运动提供了线索。该过程的延时成像允许在迁移过程中确定和评估细胞轨迹。这些细胞轨迹反过来又决定了细胞迁移的速度和方向性（图5）。
首先优化仅使用野生型MEPM细胞的培养和测定条件非常重要。在腭架成功胰蛋白酶消化并得到的单细胞悬浮液镀过夜后，绝大多数（约90%）细胞将很容易附着在培养皿的生长表面上。如果细胞不易粘附，则培养条件可能存在问题。最初，粘附的细胞看起来相当均匀，具有三角形或略微细长的形状，但是当它们生长到高密度时，它们变得更加纺锤形和细长（图2）。如果细胞变得体积过大或多核化，则不应将其用于实验。这种优化还将建立成功生长（汇合时间）和伤口修复（闭合时间）的基本野生型参数。细胞应该通过几乎每天增加一倍的数量来增殖，并且在延时图像中，显示出〜5-10μm / h的运动性。同样，如果在任何涉及野生型突变体比较的后续实验中，野生型细胞不满足这些基本参数，则可能需要将实验排除在分析之外。例如，野生型MEPM细胞需要36-40小时才能使用2孔硅胶插入物完全闭合伤口。如果在实验中，野生型细胞需要明显超过40小时才能闭合伤口，那么整个实验将是可疑的。MEPM细胞的性能差可能是由于1）冷冻等分试样质量差，2）恢复不良，或3）分化过度。分化或衰老的细胞可以被视觉检测到，因为它们长得非常大并且不会分裂。应避免具有大量此类细胞的培养物。一般来说，在10倍物镜的视野中应该没有异常细胞（图3）;视野外的一两个像元不应对分析产生重大影响。将分析限制在两个细胞传代（上图）极大地有助于保持MEPM细胞的质量。
对于使用原代MEPM细胞的2D培养和伤口修复测定，成功的关键要求是高初始细胞密度。该要求首先在伤口修复测定的优化过程中确定，其中细胞接种在>1400个细胞/ mm2。然后，将迁移到伤口中的细胞密度用作2D培养测定中的接种密度。~300个细胞/mm2 的接种密度形成了细胞流，同时仍然允许自动分析细胞轨迹。密度高于300个细胞/mm2 往往会形成更生动的流，可以用眼睛可视化，但使单个细胞追踪变得困难。在比较来自野生型和突变胚胎的原代MEPM细胞时，尽管无需计算分析即可评估伤口闭合延迟，但眼睛可能无法识别流形成和方向性差异。如果细胞密度过高或图像质量差/模糊，例如由于失焦，则可能难以进行自动细胞追踪。在这种情况下，可以使用手动细胞追踪来确定使用ImageJ的伤口修复测定中的细胞轨迹。极低浓度的Hoechst核染色剂（MEPM培养基中的3μL / mL 20 mM溶液）也可用于促进细胞追踪;然而，荧光激光的毒性可能是长期使用的问题。
对于手动跟踪，从伤口闭合的末端向后追溯细胞更容易，直到高细胞密度掩盖了进一步的跟踪。即使是部分细胞轨迹，当与细胞群组合时，也是有益的。与伤口修复检测相反，2D细胞培养分析需要自动细胞跟踪，这是选择中间细胞密度的原因之一。最后，基于MEPM的敏感原发性分析可用于鉴定可能影响上颚升高的化合物和途径。先前的研究表明，PI3K-AKT途径的激活改善了Specc1l突变MEPM细胞21的细胞速度和方向性。其他MEPM研究也使用各种生长因子或药物治疗来刺激下游信号级联或评估增殖22，29，30，44，45。因此，基于MEPM的分析提供了一种快速方法来识别更多的积极或消极的调节因素，然后可以在体内进行验证。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目部分得到了美国国立卫生研究院拨款DE026172（I.S.）和GM102801（A.C.）的支持。I.S.还得到了生物医学卓越研究中心（COBRE）赠款（国家普通医学科学研究所P20 GM104936），堪萨斯州IDeA生物医学研究卓越网络赠款（国家普通医学科学研究所P20 GM103418）和堪萨斯州智力和发育障碍研究中心（KIDDRC）赠款（U54 Eunice Kennedy Shriver国家儿童健康与人类发展研究所）的部分支持， HD090216）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| Conical tubes, 15 mL (x1) | Midwest Scientific | C15B | |
| Debian operating system | computational analysis of time-lapse images | ||
| Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS Onstage Incubator | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | Dissection |
| Instrument sterilizer bead bath | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microcetrifuge tubes, 1.5mL | Avant | 2925 | |
| Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight | Roboz | RS-5910 | Dissection |
| NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Silicone Insert, 2-well | Ibidi | 80209 | |
| Small Perforated Stainless Steel Spoon | Fine Science Tools | MC17C | Dissection |
| Spring Scissors, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile 10 cm dishe(s) | Corning | 430293 | |
| Sterile 12-well plate(s) | PR1MA | 667512 | |
| Sterile 6-well plate(s) | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Sterile PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sterile plastic bulb transfer pipette | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| Trypsin, 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
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