Summary
يقدم هنا بروتوكول للحفاظ على انقباض الأوعية الدموية لأنسجة الرئة المورين PCLS ، مما يؤدي إلى صورة ثلاثية الأبعاد متطورة للمجرى الوعائي الرئوي والمجرى الهوائي ، والتي يمكن الحفاظ عليها لمدة تصل إلى 10 أيام عرضة للعديد من الإجراءات.
Abstract
التصور من أنسجة الرئة مورين يوفر معلومات هيكلية وخليوية قيمة بشأن مجرى الهواء الكامنة وvasculature. ومع ذلك ، فإن الحفاظ على الأوعية الرئوية التي تمثل حقا الظروف الفسيولوجية لا يزال يمثل تحديات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التكوين الدقيق لرئتي مورين يؤدي إلى تحديات تقنية في إعداد عينات للصور عالية الجودة التي تحافظ على التركيب الخلوي والهندسة المعمارية. وبالمثل ، يمكن إجراء فحوصات الانقباض الخلوي لدراسة إمكانات الخلايا للاستجابة لمغيري الأوعية في المختبر، ولكن هذه المقايسات لا تستنسخ البيئة المعقدة للرئة السليمة. وعلى النقيض من هذه القضايا التقنية، يمكن تطبيق طريقة قطع شريحة الرئة بدقة (PCLS) كبديل فعال لتصور أنسجة الرئة في ثلاثة أبعاد دون تحيز إقليمي وتكون بمثابة نموذج انقباض بديل حي لمدة تصل إلى 10 أيام. وقد حافظت الأنسجة المعدة باستخدام PCLS الهيكل والتوجه المكاني، مما يجعلها مثالية لدراسة عمليات المرض في الجسم الحي السابق. يمكن تصور موقع الخلايا الذاتية التي تحمل علامة tdTomato في PCLS التي يتم حصادها من نموذج مورين مراسل tdTomato غير القابل للاختزال بنجاح عن طريق المجهر الكونفوكوكال. بعد التعرض لمكونات الأوعية الدموية ، يوضح PCLS الحفاظ على كل من انقباض الأوعية وبنية الرئة ، والتي يمكن التقاطها بواسطة وحدة الفاصل الزمني. بالاقتران مع الإجراءات الأخرى، مثل لطخة الغربية وتحليل الحمض النووي الريبي، PCLS يمكن أن تسهم في فهم شامل للشلالات الإشارات التي تكمن وراء مجموعة واسعة من الاضطرابات ويؤدي إلى فهم أفضل للفيزيولوجيا المرضية في أمراض الأوعية الدموية الرئوية.
Introduction
تقدم في إعداد وتصوير أنسجة الرئة التي تحافظ على المكونات الخلوية دون التضحية الهيكل التشريحي توفير فهم مفصل للأمراض الرئوية. القدرة على تحديد البروتينات والحمرنا الريبي، والمركبات البيولوجية الأخرى مع الحفاظ على الهيكل الفسيولوجي يقدم معلومات حيوية عن الترتيب المكاني للخلايا التي يمكن أن توسع فهم الفيزيولوجيا المرضية في العديد من الأمراض الرئوية. يمكن أن تؤدي هذه الصور التفصيلية إلى فهم أفضل لأمراض الأوعية الدموية الرئوية ، مثل ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي ، عند تطبيقها على النماذج الحيوانية ، مما قد يؤدي إلى تحسين الاستراتيجيات العلاجية.
على الرغم من التقدم في التكنولوجيا، والحصول على صور عالية الجودة من أنسجة الرئة مورين لا يزال يشكل تحديا. تحرك الدورة التنفسية ضغط داخلي سلبي يتم توليده أثناء الاستنشاق1. عند الحصول تقليديا الخزعات وإعداد عينات الرئة للتصوير، يتم فقدان الانحدار الضغط السلبي مما أدى إلى انهيار مجرى الهواء وvasculature، والتي لم تعد تمثل نفسها في حالتها الراهنة. لتحقيق صور واقعية تعكس الظروف الحالية ، يجب إعادة تضخم الشعب الهوائية الرئوية ، وثقب الأوعية الدموية ، وتغيير الرئة الديناميكية إلى لاعبا اساسيا ثابتا. يسمح تطبيق هذه التقنيات المتميزة بالحفاظ على السلامة الهيكلية ، والرئة الوعائية ، والمكونات الخلوية ، بما في ذلك الخلايا المناعية مثل الضامة ، مما يسمح بالنظر إلى أنسجة الرئة على أقرب ما يمكن إلى حالته الفسيولوجية.
الدقة قطع تشريح الرئة (PCLS) هو أداة مثالية لدراسة التشريح وعلم وظائف الأعضاء من الأوعية الدموية الرئوية2. PCLS يوفر التصوير التفصيلي للأنسجة الرئة في ثلاثة أبعاد مع الحفاظ على المكونات الهيكلية والخلوية. وقد استخدمت PCLS في النماذج الحيوانية والبشرية للسماح للصور الحية وعالية الدقة من الوظائف الخلوية في ثلاثة أبعاد, مما يجعلها أداة مثالية لدراسة الأهداف العلاجية المحتملة, قياس تقلص مجرى الهواء الصغيرة ودراسة الفيزيولوجيا المرضية لأمراض الرئة المزمنة مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن, ILD, وسرطان الرئة3. وباستخدام تقنيات مماثلة، يمكن أن يحافظ تعرض عينات PCLS لمكونات الأوعية على هيكل الرئة وانقباض الأوعية، وتكرارها في ظروف المختبر. جنبا إلى جنب مع الحفاظ على الانقباض، يمكن أن تخضع العينات المعدة لتحليل إضافي مثل تسلسل الحمض النووي الريبي، وصمة عار غربية، وقياس التدفق الخلوي عند إعدادها بشكل صحيح. وأخيرا، يمكن للخلايا المسماة بلون المراسل والتي تحمل علامة تضان tdTomato بعد حصاد الرئة الحفاظ على وضع العلامات بعد إعداد الميكروسليكس، مما يجعلها مثالية لدراسات تتبع الخلايا. يوفر دمج هذه التقنيات نموذجا متطورا يحافظ على الترتيب المكاني للخلايا وانقباض الأوعية التي يمكن أن تؤدي إلى فهم أكثر تفصيلا لسلاسل الإشارات والخيارات العلاجية المحتملة في مرض الأوعية الدموية الرئوية.
في هذه المخطوطة، تتعرض أنسجة الرئة المورين PCLS إلى الأوعية الدموية، مما يدل على السلامة الهيكلية المحفوظة وانقباض الأوعية. وتبين الدراسة أن الأنسجة التي تم إعدادها والتعامل معها بشكل مناسب يمكن أن تظل قابلة للحياة لمدة 10 أيام. كما توضح الدراسة الحفاظ على الخلايا ذات الفلورة الذاتية (tdTomato)، مما يسمح للعينات بتوفير صور عالية الدقة للرئة والعمارة. وأخيرا، تم وصف طرق للتعامل مع شرائح الأنسجة وإعدادها لقياس الحمض النووي الريبي واللطخة الغربية للتحقيق في الآليات الأساسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وكانت جميع رعاية الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية لمستشفى بوسطن للأطفال ووافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها على بروتوكولات. الفئران المستخدمة في هذه الدراسة هي الفئران البرية من النوع C57/B6 والفئران المتقاطعة Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.
1. إعداد الحلول
- إعداد حل العازلة الفوسفات (1x PBS) و 2٪ agarose الحل المطلوب خلال التجربة مقدما.
- مزيج 2 غ مسحوق الآغاروز في 100 مل من الماء autoclaved. سخنيه في الميكروويف بضع ثوان في كل مرة حتى يصبح الحل واضحا.
- ضع المحلول في حمام مائي عند 42 درجة مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظة: يمكن تخزين كل من PBS و 2٪ agarose في درجة حرارة الغرفة لأسابيع.
2. استخراج الرئة الماوس
- القتل الرحيم الماوس بجرعة زائدة isoflurane. تحقيق جرعة زائدة isoflurane عن طريق وضع كمية صغيرة من isoflurane على ورق الأنسجة في المستوى الأدنى ووضع الماوس في المستوى العلوي في مجفف. يبقى الفأر في المجفف حتى فاقد الوعي.
- ضمان وفاة الماوس عن طريق تطبيق ضغط أدنى على الرقبة وسحب caudal على الذيل. جلب الماوس إلى السطح تشريح.
- ضع الماوس في وضعية السطانة و قم بتأمينه في مكانه و قم بتسجيل الكفوف و الأنف إلى الطاولة بشريط لاصق.
- رش سطح البطن من الماوس مع الإيثانول 70٪ ومسح الايثانول الزائد.
- ارفع جلد البطن من الفأرة مع ملقط في موقع المثانة وقطع في خط الوسط مع مقص الجراحية، والانتقال بشكل متفوق على منطقة عنق الرحم، وفضح القصبة الهوائية.
- رفع طبقة اللفافة الكامنة مع ملاقط وقطع مع مقص الجراحية لفضح الأعضاء الحشوية والمقصورة الوسيطة، وقطع مرة أخرى أقل شأنا إلى متفوقة.
- قطع القص في منتصف الخط لفضح القلب والرئة.
- باستخدام تشريح حاد، فصل الحجاب الحاجز من الكبد ومقصورة البطن.
- تحديد موقع الوريد الأجوف السفلي (IVC) تحت الأمعاء وقطع IVC.
- حدد موقع البطين الأيمن.
ملاحظة: سيكون للبطين الأيمن مظهر أخف مقارنة بالبطين الأيسر، وينبغي تصور الحاجز داخل البطين، الذي يفصل البطين الأيمن عن البطين الأيسر. - حقن 0.5 مل من 1٪ الهيبارين مجزأة إلى البطين الأيمن مع إبرة فراشة 25-30 G ومن ثم تدفق ببطء ولكن بثبات مع 10-15 مل من 1x PBS (الشكل 1A).
- توخي الحذر من إدخال الإبرة من خلال القلب وحقن الهيبارين في تجويف الوساطة.
ملاحظة: حقن برنامج تلفزيوني 1x يتحول أنسجة الرئة البيضاء. يجب أن يكون السائل الذي يتغلغل من الشريان الأورطي البطني واضحا وعديم اللون وقد يصبح الكبد أبيض المظهر بعد التنظيف الناجح.
- توخي الحذر من إدخال الإبرة من خلال القلب وحقن الهيبارين في تجويف الوساطة.
- حدد موقع الحنجرة وتشريح اللفافة المحيطة والأنسجة باستخدام ملاقط طرف حادة.
- ضع الغرز الجراحي تحت القصبة الهوائية وربط عقدة جراحية بشكل فضفاض.
- وضع ثقب صغير في القصبة الهوائية متفوقة على سلسلة و canulate مع 20 G إبرة حادة النهاية.
- شد الغرز حول الإبرة والقرصة باستخدام عقدة جراحية.
- حقن 2.5-4 مل من الآغاروز في القصبة الهوائية ورصد التضخم في الرئة.
- بعد غرس agarose، صب الباردة، المبردة 1x برنامج تلفزيوني على الرئة لترسيخ agarose.
- قطع القصبة الهوائية متفوقة على خياطة الجراحية وتشريح الرئة والقلب من mediastinum عن طريق إزالة أي التصاقات واللفافة.
- بعد التجسيد، ضع في 1x DMEM (ما يكفي لغمر الأنسجة) في طبق بيتري للحفاظ على الجليد. شريحة على الفور فص واحد باستخدام جهاز هزاز (الشكل 1B).
3. الدقة قطع شرائح الرئة
- إرفاق العينة إلى المنصة مع superglue، والحفاظ على الجانب الوسيط من العينة التي تواجه ما يصل.
- ملء حاوية العينة مع برنامج تلفزيوني 1x، وضمان أن العينة مغمورة تماما.
- ملء الحاوية المحيطة حاوية العينة مع الجليد للحفاظ على المحيطة PBS وعينة الباردة.
- قم بتشغيل الهزاز واضبط الإعدادات المطلوبة أدناه.
- تعيين سمك إلى 300um.
- تعيين التردد إلى 100 هرتز.
- تعيين السعة إلى 0.6 مم.
- تعيين السرعة إلى 5 ميكرومتر / ثانية.
- باستخدام وجع ألين، قم بتحويل حامل النصل إلى الوضع الآمن وافتح الفكين لإدخال شفرة.
- تشديد الفكين مع وجع ألين وتحويل حامل النصل إلى الموقف المناسب للتقطيع.
- ضع العينة والمنصة على المربع وانزلق أمام النصل.
- ملء مربع حول منصة عينة مع برنامج تلفزيوني 1x حتى يتم غمر العينة.
- جلب شفرة الهزاز تصل إلى حافة الكتلة وخفض يدويا شفرة حتى يكون حتى مع الجزء العلوي من العينة.
- تأكيد الإعدادات المناسبة وتشغيل الهزاز (الشكل 2).
- كما يتم قطع شرائح جديدة، وإزالة العينات من برنامج تلفزيوني ووضعها في طبق بيتري عقيمة مع 10 مل من 1x DMEM تحتوي على 1x المضادة للمضادات الحيوية المضادة للميكوزيك.
- عند الانتهاء، تراجع عن النصل بالكامل ثم استخدم مفتاح ألين لرفع النصل إلى وضع آمن.
- تخزين العينات في 1x DMEM في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع الحفاظ على البقاء لمدة تصل إلى 10 أيام (انظر تجربة الجدوى أدناه).
4. مثال تجربة الأوعية
- ضع شريحة هزاز على شريحة المجهر.
- قبل وضعه على الشريحة، استخدم مسح التنظيف للتخلص من الوسط الزائد (PBS).
- ضع العينة تحت المجهر على النقيض من المرحلة واستخدم التكبير 10-20x لتحديد السفينة.
- ضع 500 ميكرولتر من الأوعية، مثل 60 mCl أو 1 ميكرومتر إندوثين-1 لغمر الشريحة بالكامل.
- مراقبة والتقاط الفيديو عن طريق تسجيل ل30 ق -60 ق (فيديو 1).
5. إعداد الأنسجة لتحلل الحمض النووي الريبي أو البروتين على PCLS
- قبل بدء التجربة، ملء مربع رغوة البوليسترين صغيرة مع 1 لتر من النيتروجين السائل.
- ضع أنبوبي طرد مركزي صغيرين (1.5 مل) في الحاوية مع النيتروجين السائل قبل البدء.
ملاحظة: يجب أن يبرد النيتروجين السائل خارج الأنابيب ، ومع ذلك ، لا يكون في الداخل. تأكد من التعامل مع النيتروجين السائل بعناية ولا تعرض الجلد للنيتروجين السائل. استخدم ملقط وقفازات لوضع وإزالة أنابيب من منطقة الجزاء. - ضع 4-5 شرائح هزاز طازجة في وعاء هاون.
- صب 5-10 مل من N2 السائل على رأس شرائح في وعاء هاون.
- بسرعة استخدام الحشرات لطحن شرائح تجميد فلاش إلى مسحوق قبل النيتروجين السائل يتبخر.
ملاحظة: يجب أن تتكثف الأنسجة إلى مسحوق ناعم. إذا لم يكن كذلك، إضافة النيتروجين السائل إضافية حتى يتحقق. - باستخدام مغرفة مختبر الصلب (prechilled مع النيتروجين السائل)، مغرفة مسحوق في اثنين من أنابيب الطرد المركزي المبردة.
- ليس المسحوق بإضافة 500 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي للمضي قدما في عزل الحمض النووي الريبي أو 500 ميكرولتر من العازلة RIPA (يحتوي على مثبطات 1x protease) للمضي قدما في تحلل البروتين.
- تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى عزل الحمض النووي الريبي إضافية، قياس BCA، ولطخة الغربية.
6. تحديد الجدوى
- بعد إعداد الهزاز، ضع شريحتين من الرئة في صفيحة ثقافة 24 بئرا مع 450 ميكرولتر من وسائط DMEM و50 ميكرولتر من كاشف قابلية البقاء على الخلايا (تأكد من غمر الأنسجة بالكامل).
- ضع العينات مرة أخرى في 5٪ CO2 في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع الحد الأدنى من التعرض للضوء.
- في الصباح، مراقبة الحل لتغيير اللون. يتحول المحلول الأزرق إلى اللون الوردي عندما يكون النسيج قابلا للحياة.
7. الحفاظ على وضع العلامات الخلية
- علاج Cdh5-CreERT2 المعدلة وراثيا عبرت مع الماوس TdTomato Ai14 مع حقن الملكية الفكرية من تاموكسيفين (2 ملغ / يوم) لما مجموعه 5 أيام (الجرعة الإجمالية 10 ملغ تاموكسيفين) للحث على تسمية tdTomato الخلايا الإيجابية كري.
- بعد أسبوع واحد من الحقن، قم بإعداد الرئتين باستخدام الخطوات المذكورة أعلاه من 1 إلى 3.
- بعد إعداد شريحة الرئة الدقيقة، ضع الأنسجة على شريحة المجهر وضع غطاء فوق الأنسجة.
- استخدام المجهر confocal للكشف عن تلطيخ tdTomato (باستخدام الطول الموجي الإثارة 555 نانومتر).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عند إضافتها إلى الخلايا أو الأنسجة ، يتم تعديل كاشف الجدوى عن طريق تقليل بيئة الأنسجة القابلة للحياة ويتحول إلى اللون الوردي / الأحمر ، ويصبح فلوريا للغاية. تظهر التغييرات اللونية التمثيلية التي تم اكتشافها من اليوم 0-1 واليوم 9-10 في الشكل 3. كما لوحظ، بدأ الحل الأزرق وتحول الوردي بين عشية وضحاها، مما يدل على الجدوى. يحدث تغيير اللون عادة في غضون 1-4 ساعة; ومع ذلك، قد يكون وقتا أطول ضروريا. وللتقصي من أجل الجدوى، استخدم قارئ لوحة لتحديد امتصاص عينة معدة من الهزاز وشريحة رئة ثابتة بنسبة 4٪ PFA، تعمل كعنصر تحكم. وقرأت الحلول التي احتضنت فيها العينات على امتصاص 562 نانومتر و630 نانومتر بناء على توصية الشركة المصنعة. الفرق اليومي بين الامتصاص في الطول الموجي 562 نانومتر و 630 نانومتر للأنسجة المعدة للهزاز والمقارنة مع أنسجة التحكم تظهر في الشكل 3.
لإثبات انقباض أنسجة الرئة المعدة للهزاز ، تم وضع قطعة جديدة من الأنسجة تحت المجهر الميداني الساطع في 400x وعولجت باستخدام KCL أو Endothelian-1 حتى غمرت الأنسجة. شريط فيديو تم التقاطه على مدى 30-60 ق من الأنسجة يكشف انقباض الأوعية الدموية (فيديو 1).
لإثبات الحفاظ على وضع العلامات على الخلايا بعد أسبوع واحد من حقن تاموكسيفين ، لوحظت شرائح الرئة التي تم الحصول عليها بعد تقسيم الهزاز باستخدام البروتوكول أعلاه تحت المجهر الكونفوكوكال. و tdTomato وضع العلامات في شرائح الرئة هو موضح في الشكل 4.
الشكل 1: إعداد أنسجة الرئة مورين لقسم الهزاز. (أ) يتم علبة RV مع إبرة فراشة 30G لتسهيل تبديل الحلول من الهيبارين إلى برنامج تلفزيوني. (ب)فصوص الرئة كلها بعد تضخم agarose يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: شرائح الرئة باستخدام قسم الهزاز. سمك: 300 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:تجربة الجدوى لشرائح PCLS من اليوم 1 إلى اليوم 10. (أ) صور تمثيلية لتغيير لون الكاشف من الأنسجة التي أعدت PCLS مقابل 4٪ من الأنسجة الثابتة PFA. تم وضع أنسجة PCLS الطازجة و4٪ من أنسجة PFA الثابتة في 450 ميكرولتر من وسائط الأنسجة و50 ميكرولتر من كاشف الجدوى. لون الحل في البداية الأرجواني، كما يمكن أن ينظر إليه في اليوم 0 واليوم 9. بعد احتضان بين عشية وضحاها، تغير الحل الذي يحتوي على أنسجة PCLS أعدت حديثا إلى اللون الأرجواني / الوردي (اليوم 1 واليوم 10) بسبب البيئة المتناقصة للأنسجة الحية. (ب)تحديد كمي لقابلية PCLS للاستمرار من اليوم الأول إلى اليوم العاشر بنسبة الامتصاص عند 562 نانومتر و630 نانومتر مع قارئ لوحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مظاهرة من الخلايا الإيجابية tdTomato الحفاظ عليها وسم بعد الحصاد. إعداد PCLS هو من ماوس معدلة وراثيا Cdh5-tdT. مقياس الشريط = 20 ميكرومتر الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: انقباض الأوعية باستخدام Endothelin-1 على PCLS. يتم نفخ فئران النمط البري C57/B6 مع 1.5 مل من 1.5٪ من الآغاروز وتقسم إلى 130 ميكرومتر باستخدام هزاز. تم وضع قطعة جديدة من الأنسجة تحت المجهر الميداني الساطع في 400x وعولجت باستخدام KCL أو Endothelian-1. التكبير: 400x. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المخطوطة، يتم وصف طريقة محسنة لإنتاج صور عالية الدقة لأنسجة الرئة المورين التي تحافظ على بنية الأوعية الدموية وتحسين المرونة التجريبية، وذلك على وجه التحديد باستخدام تطبيق PCLS للحصول على ميكروسيلكات من أنسجة الرئة التي يمكن مشاهدتها في ثلاثة أبعاد مع الانقباض المحفوظة للمحرك الوعائي. باستخدام كاشف الجدوى، يوضح البروتوكول أن الشرائح المعدة بعناية والمحفوظة يمكن أن تحتفظ بقابلية البقاء لأكثر من أسبوع. تسمح الجدوى المحفوظة للميكروبات بإمكانية إجراء تجارب متعددة وطويلة على هياكل الأوعية الدموية والمجرى الهوائي ، مما يجعلها عينة مثالية لاختبار استجابة الجسم الحي السابق لأدوية متعددة ، وتقييم الآليات الجزيئية الأساسية ، واختبار الكواشف. وهذا يجعل العينات المعدة منصة مثالية لدراسة الآثار العلاجية المحتملة على لهجة الأوعية الدموية قبل التجارب في الجسم الحي 4. إن الحفاظ على مجرى الهواء الرئوي و الأوعية الدموية يسمح بمعالجة العينات المعدة بتقنيات إضافية مثل اختبار الانقباض الموضح في هذه المقالة والملخص في الجدول 1. وهذا يتيح الفرصة لتوفير صور عالية الدقة تفصل الترتيب المكاني للرئة الوعائية وسلاسل الإشارات، مما يساهم في مسببات أمراض الأوعية الدموية الرئوية.
إعداد الأنسجة المجهرية للتجريب هو تقنية تستخدم هزاز، أو شفرة تهتز، لإنتاج شرائح عضوية قطع دقيقة. وهذا يسمح لزيادة الدقة والتكرار مقارنة بالتقنيات التقليدية5. Microslices من الرئتين التي تم الحصول عليها مع PCLS الحفاظ على الهيكل الفسيولوجي للأنسجة الرئة إلى المستوى الخلوي، مما يجعلها أداة مفيدة لدراسة مجموعة متنوعة من أمراض الأوعية الدموية الرئوية. وقد استخدمت هذه التكنولوجيا في كل من النماذج الحيوانية والبشريةلدراسةتشريح الرئة المعقدة وأمراض الرئة، مع التركيز بشكل خاص على التعرض للسموم، والأمراض المعدية، والدراسات المناعية 6و7و8. اعتمادا على الفيزيولوجيا المرضية الكامنة، يمكن الحصول على الميكروسليكس من فصوص محددة من الفائدة أو واحد / كل الفصوص لمقارنة التغايرية المرض. شرائح رقيقة جدا يؤدي إلى صعوبة في الحفاظ على السلامة الهيكلية، في حين شرائح سمكا قد يكون أكثر صعوبة لأداء تلطيخ إضافية أو عميقة في تصوير الأنسجة.
خاصة بأمراض الأوعية الدموية، وقد استخدمت PCLS لدراسة ارتفاع ضغط الدم الشريان الرئوي (PAH)، مما يسمح لنموذج متطور لتحليل آثار العلاجات المحتملة9،10،11. الحفاظ على انقباض الأوعية الدموية في عينات الرئة مورين له العديد من الفوائد العلاجية والتحقيقية. من خلال دمج تقنية الحفاظ على كل من هيكل وانقباض الأوعية الدموية الرئوية ، يمكن للعينات المعدة نموذج أمراض الأوعية الدموية الرئوية في الجسم الحي. وقد ثبت هذا في الماضي من قبل Rieg وآخرون، الذين مع عينات PCLS كانت قادرة على إثبات أن الأوردة الرئوية كانت أكثر حساسية مع a1-ناهضات وناهضات B2، مما يشير إلى استخدام هذه الأدوية في فشل القلب الأيسر قد يسبب زيادة وذمة رئوية12. باستخدام هذا النموذج لدراسة آثار الأدوية، يساعد الجسم الحي السابق في تحديد العوامل العلاجية المحتملة للتجارب السريرية المحتملة. في هذه المخطوطة، يصف البروتوكول طرق التعامل مع الأنسجة وتخزينها مع الحفاظ على صلاحيتها لمدة 10 أيام، مما يسمح بمراقبة الأنسجة بعد التدخلات المحتملة ويوفر مرونة تجريبية أكبر. وقد طبقت الدراسات السابقة أساليب مماثلة للحفاظ على انقباض مجرى الهواء في نماذج الربو، مع تأثير IL-13 تستمر لمدة تصل إلى 15 يوما3. يمكن أن يؤدي الحمض النووي الريبي المناعي والسيتوكينات إلى فهم أفضل للأمراض الكامنة المسؤولة عن تطور الأمراض وتطورها في مختلف أمراض الأوعية الدموية. يمكن للعينات المعدة الاحتفاظ بوسم الخلايا بعد التحضير ، كما هو موضح في هذه المخطوطة مع الحفاظ على tdTomato المسمى خلايا Cdh5 + البطانية. الحفاظ على مثل هذه الوسم في عينات أعدت الهزاز يسمح للهيكل للحفاظ على جنبا إلى جنب مع وضع العلامات الخلية، مما يجعلها أداة مثالية لإجراء تجارب تتبع الخلية. وأخيرا، فإن العينات المعدة عرضة لمزيد من التحقيق مثل تحلل الحمض النووي الريبي أو البقعة الغربية الموصوفة في هذا البروتوكول لمواصلة دراسة الفيزيولوجيا المرضية الأساسية والآليات التي تسبب تطور المرض.
على الرغم من مزاياه لتقنيات أخرى، هناك قيود على الأنسجة التي أعدت PCLS. يؤدي إجراء PCLS إلى تحويل الرئة الديناميكية إلى مباراة ثابتة ، مما يوفر لقطة في وقت الخلايا والجزيئات الموجودة داخل أنسجة الرئة في وقت الخزعة. ما لم يتم الحصول على عينات عديدة، فإنه لا يفسر عدم التجانس واسعة ينظر عادة في العديد من الأمراض الرئوية مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). تقتصر الأنسجة المعدة باستخدام PCLS بشكل رئيسي على مجرى الهواء الصغير وأمراض الأوعية. ويرجع ذلك إلى التحديات التقنية مع حصاد الأنسجة، حيث أن القصبة الهوائية عادة ما تكون مشقوقة لتضخم الرئة وتحديد وعزل القصبات الهوائية الكبيرة أمر صعب. هذه القيود التقنية تجعل استخدام أنسجة PCLS دون المستوى الأمثل لدراسة الشعب الهوائية الكبيرة والشعب الهوائية التي تجري. كما أن الاختبار الديناميكي محدود أيضا، مما يجعله منصة أقل من مثالية لدراسة أمراض الرئة المرتبطة بجهاز التنفس الصناعي وداء البارو تراوما. وأخيرا، ركز تطبيق PCLS على مجال أمراض الرئة في المقام الأول على أنسجة الرئة مورين، وهناك حاجة إلى مزيد من الاختبار والبروتوكولات قبل تطبيقها على الأنسجة البشرية في سيناريو ذات الصلة سريريا.
وباختصار، توفر المخطوطة طريقة تكميلية للحفاظ على انقباض الأوعية الدموية لأنسجة الرئة المورين PCLS، مما يؤدي إلى صور عالية الدقة للرئة الوعائية لمدة تصل إلى 10 أيام تحتوي على خلايا فلورية داخلية والعديد من الإجراءات الأخرى.
الجدول 1: خصائص واستخدامات مختلف أجهزة إعادةتشكيل الأوعية . (*المستخدمة في هذه الدراسة) الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.
Acknowledgments
ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتورين يوان هاو وكايفنغ ليو على دعمهما التقني. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة 1R01 HL150106-01A1 ، وزمالة باركر ب. فرانسيس ، وجائزة أبحاث رابطة ارتفاع ضغط الدم الرئوي للدكتور كي يوان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
- Sparrow, D., Weiss, S. T.
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Rosales Gerpe, M. C., et al. Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liu, R., et al. Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses. Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).
- de Graaf, I. A., et al. Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).
- Alsafadi, H. N., et al. Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Springer, J., Fischer, A. Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices. The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).
- Suleiman, S., et al. Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation. Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).
- Rieg, A. D., et al. Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices. PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Deng, C. Y., et al. Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture. PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).
- Sandker, S. C., et al. Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).
- Naik, J. S., et al. Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 98 (3), Bethesda, Md. 1119-1124 (2005).
- Lopez-Lopez, J. G., et al. Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).
- Gonzalez-Tajuelo, R., et al. Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice. Arthritis & Rheumatology. 72 (3), Hoboken, N.J. 477-487 (2020).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Nishiyama, S. K., et al. Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 122 (2), Bethesda, Md. 354-360 (2017).
- Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).
- Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores. Hypertension. 29, Dallas, Tex. 222-227 (1997).
- Vecchione, C., et al. Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma. The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).
