Summary
Presentert her er en protokoll for å bevare vaskulær kontraktilitet av PCLS murin lungevev, noe som resulterer i et sofistikert tredimensjonalt bilde av lungevaskulaturen og luftveiene, som kan bevares i opptil 10 dager som er utsatt for mange prosedyrer.
Abstract
Visualiseringen av murin lungevev gir verdifull strukturell og cellulær informasjon om underliggende luftvei og vaskulatur. Bevaring av lungefartøy som virkelig representerer fysiologiske forhold gir imidlertid fortsatt utfordringer. I tillegg resulterer den delikate konfigurasjonen av murin lunger i tekniske utfordringer med å forberede prøver for bilder av høy kvalitet som bevarer både cellulær sammensetning og arkitektur. På samme måte kan cellulære kontraktilitetsanalyser utføres for å studere potensialet til celler for å reagere på vasokonstriktorer in vitro, men disse analysene reproduserer ikke det komplekse miljøet i den intakte lungen. I motsetning til disse tekniske problemene kan den presisjonskuttede lungeskiven (PCLS) brukes som et effektivt alternativ til å visualisere lungevev i tre dimensjoner uten regional skjevhet og tjene som en live surrogatkontraktilitetsmodell i opptil 10 dager. Vev tilberedt ved hjelp av PCLS har bevart struktur og romlig orientering, noe som gjør det ideelt å studere sykdomsprosesser ex vivo. Plasseringen av endogene tdTomato-merkede celler i PCLS høstet fra en induserbar tdTomato reporter murine modell kan vellykket visualiseres ved konfikal mikroskopi. Etter eksponering for vasokonstriktorer demonstrerer PCLS bevaring av både karkontraktilitet og lungestruktur, som kan fanges opp av en tidsforløpmodul. I kombinasjon med de andre prosedyrene, som vestlig blot- og RNA-analyse, kan PCLS bidra til den omfattende forståelsen av signalkaskader som ligger til grunn for et bredt spekter av lidelser og fører til en bedre forståelse av patofysiologien i lungevaskulære sykdommer.
Introduction
Fremskritt i fremstilling og avbildning av lungevev som bevarer cellulære komponenter uten å ofre anatomisk struktur gir en detaljert forståelse av lungesykdommer. Evnen til å identifisere proteiner, RNA og andre biologiske forbindelser samtidig som man opprettholder fysiologisk struktur, gir viktig informasjon om det romlige arrangementet av celler som kan utvide forståelsen av patofysiologien i mange lungesykdommer. Disse detaljerte bildene kan føre til en bedre forståelse av lungevaskulære sykdommer, som pulmonal arterie hypertensjon, når de brukes på dyremodeller, noe som potensielt fører til forbedrede terapeutiske strategier.
Til tross for fremskritt innen teknologi, er det fortsatt en utfordring å skaffe bilder av murin lungevev av høy kvalitet. Åndedrettssyklusen drives av et negativt intrathoracic trykk generert under innånding1. Når du tradisjonelt skaffer biopsier og forbereder lungeprøver for avbildning, går den negative trykkgradienten tapt, noe som resulterer i sammenbrudd av luftveiene og vaskulaturen, som ikke lenger representerer seg selv i sin nåværende tilstand. For å oppnå realistiske bilder som reflekterer dagens forhold, må lungeveiene fylles opp igjen, og vaskulaturen perfunderes, og endrer den dynamiske lungen til en statisk armatur. Anvendelsen av disse distinkte teknikkene gjør det mulig å bevare strukturell integritet, lungevaskulatur og cellulære komponenter, inkludert immunceller som makrofager, slik at lungevev kan ses så nær sin fysiologiske tilstand som mulig.
Presisjonskuttet lungeslicing (PCLS) er et ideelt verktøy for å studere anatomien og fysiologien til lungevaskulatur2. PCLS gir detaljert bildebehandling av lungevevet i tre dimensjoner samtidig som strukturelle og cellulære komponenter bevares. PCLS har blitt brukt i dyre- og menneskelige modeller for å tillate levende bilder med høy oppløsning av cellulære funksjoner i tre dimensjoner, noe som gjør det til et ideelt verktøy for å studere potensielle terapeutiske mål, måle liten luftveiskontraksjon og studere patofysiologien til kroniske lungesykdommer som KOLS, ILD og lungekreft3. Ved hjelp av lignende teknikker kan eksponeringen av PCLS-prøver til vasokonstriktorer bevare lungestruktur og karkontraktilitet, og gjenskape in vitro-forhold. Sammen med å bevare kontraktilitet, kan forberedte prøver gjennomgå ytterligere analyse som RNA-sekvensering, vestlig blotten og strømningscytometri når de er forberedt riktig. Til slutt kan reporterfargemerkede celler merket med tdTomato-fluorescens etter lungehøst bevare merking etter å ha forberedt mikroslikvier, noe som gjør den ideell for cellesporingsstudier. Integreringen av disse teknikkene gir en sofistikert modell som bevarer det romlige arrangementet av celler og karkontraktilitet som kan føre til en mer detaljert forståelse av signalkaskadene og potensielle terapeutiske alternativer ved lungevaskulatursykdom.
I dette manuskriptet er PCLS murin lungevev utsatt for vasokonstriktorer, som demonstrerer bevart strukturell integritet og karkontraktilitet. Studien viser at vevet som er tilberedt og håndtert på riktig måte, kan forbli levedyktig i 10 dager. Studien viser også bevaring av celler med endogen fluorescens (tdTomato), slik at prøver kan gi høyoppløselige bilder av lungevaskulaturen og arkitekturen. Til slutt er det beskrevet måter å håndtere og klargjøre vevsskiver for RNA-måling og vestlig flekk for å undersøke underliggende mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All dyrepleie var i samsvar med retningslinjene fra Boston Children's Hospital og Institutional Animal Care and Use Committee godkjente protokoller. Musene som brukes i denne studien er vill type C57 / B6 mus og Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato krysset mus.
1. Utarbeidelse av løsninger
- Forbered fosfatbufferløsning (1x PBS) og 2% agarose løsning som kreves under eksperimentet på forhånd.
- Bland 2 g agarosepulver i 100 ml autoklavert vann. Varm den opp i mikrobølgeovnen noen sekunder av gangen til løsningen er klar.
- Plasser oppløsningen i et vannbad ved 42 °C til bruk.
MERK: Både PBS og 2% agarose kan lagres ved romtemperatur i flere uker.
2. Ekstraksjon av musen lunge
- Avlivet musen ved isofluran overdose. Oppnå isofluran overdose ved å plassere en liten mengde isofluran på vevspapir i lavere nivå og plassere musen i det øvre nivået i en desiccator. Musen forblir i desiccator til bevisstløs.
- Sørg for musens død ved å bruke dårligere trykk på nakken og trekke kaudal på halen. Ta musen til dissekeringsoverflaten.
- Plasser musen i liggende stilling og fest den på plass tappepoter og nese til bord med tape.
- Spray musens ventrale overflate med 70% etanol og tørk av overflødig etanol.
- Løft bukhuden på musen med tang på blærens plassering og kutt i midtlinjen med kirurgisk saks, bevege seg overlegent til livmorhalsområdet, og eksponere luftrøret.
- Løft det underliggende fasciale laget med pinsett og kutt med kirurgisk saks for å eksponere viscerale organer og mediastinalt rom, og kutt igjen dårligere til overlegen.
- Klipp brystbenet i midtlinjen for å eksponere hjertet og lungen.
- Bruk stump disseksjon, løsne membranen fra leveren og bukrommet.
- Finn den dårligere vena cava (IVC) under tarmene og kutt IVC.
- Finn riktig ventrikel.
MERK: Høyre ventrikel vil ha et lettere utseende sammenlignet med venstre ventrikel og det intraventrikulære septumet skal visualiseres, og skiller høyre ventrikel fra venstre ventrikel. - Injiser 0,5 ml fraksjonert heparin til høyre ventrikel med en 25-30 G sommerfuglnål og skyll deretter sakte, men jevnt med 10-15 ml 1x PBS (figur 1A).
- Vær forsiktig så du ikke setter nålen gjennom hjertet og injiserer heparin i mediastinalhulen.
MERK: Injeksjonen av 1x PBS gjør lungevevet hvitt. Væsken ekstravasating fra abdominal aorta bør være klar og fargeløs og leveren kan bli hvit i utseende etter vellykket spyling.
- Vær forsiktig så du ikke setter nålen gjennom hjertet og injiserer heparin i mediastinalhulen.
- Lokaliser strupehodet og disseker den omkringliggende fascia og vev ved hjelp av stumpe tweezers.
- Plasser den kirurgiske suturen under luftrøret og bind en kirurgisk knute løst.
- Plasser et lite hull i luftrøret som er overlegen strengen og kanuler med 20 G stump nål.
- Stram suturen rundt nålen og luftrøret ved hjelp av en kirurgisk knute.
- Injiser 2,5-4 ml agarose i luftrøret og overvåk for inflasjonen i lungen.
- Etter at agarose er innpodet, hell kaldt, kjølt 1x PBS over lungen for å størkne agarose.
- Klipp luftrøret overlegen kirurgisk sutur og disseker lunge og hjerte fra mediastinum ved å fjerne eventuelle vedheft og fascia.
- Etter størkning, plasser i 1x DMEM (nok til å nedsenke vev) i en Petri-tallerken for å holde på is. Skjær straks opp én lobe med en vibratommaskin (Figur 1B).
3. Presisjonskuttede lungeskiver
- Fest prøven til plattformen med superlim, og hold medialsiden av prøven vendt opp.
- Fyll prøvebeholderen med 1x PBS, og sørg for at prøven er helt nedsenket.
- Fyll beholderen rundt prøvebeholderen med is for å holde omkringliggende PBS og prøve kaldt.
- Slå på vibratomet og juster til de ønskede innstillingene nedenfor.
- Sett tykkelsen til 300um.
- Sett frekvensen til 100 Hz.
- Sett amplituden på 0,6 mm.
- Sett hastigheten til 5 μm/s.
- Bruk en unbrakonøkkel til å dreie bladholderen i sikker posisjon og åpne kjevene for å sette inn et blad.
- Stram kjevene med en unbrakonøkkel og vri bladholderen i riktig posisjon for kutting.
- Plasser prøven og plattformen på esken og skyv den foran bladet.
- Fyll esken rundt prøveplattformen med 1x PBS til prøven er nedsenket.
- Før vibratombladet opp til kanten av blokken og senk bladet manuelt til det er jevnt med toppen av prøven.
- Bekreft de riktige innstillingene, og kjør vibratomet (Figur 2).
- Når friske skiver kuttes, fjern prøvene fra PBS og legg dem i en steril Petri-tallerken med 10 ml 1x DMEM som inneholder 1x antibiotika-antimykotika.
- Når du er ferdig, trekker du bladet helt tilbake og bruker deretter unbrakonøkkelen til å heve bladet i en sikker posisjon.
- Oppbevar prøvene i 1x DMEM i en inkubator ved 37 °C med levedyktighet bevart i opptil 10 dager (se levedyktighetseksperiment nedenfor).
4. Eksempel på vasokonstriktoreksperiment
- Plasser en vibratomskive på et mikroskopsklie.
- Før du plasserer den på lysbildet, bruk en rengjøringsserviett for å kvitte seg med overflødig medium (PBS).
- Plasser prøven under fasekontrastmikroskopi og bruk 10-20x forstørrelse for å identifisere et fartøy.
- Sett 500 μL vasokonstriktorer, for eksempel 60 mM KCl eller 1 μM Endothelin-1 for å senke lysbildet helt ned.
- Observer og ta opp videoen ved å spille inn i 30 s-60 s (Video 1).
5. Klargjøring av vevet for RNA eller proteinlys på PCLS
- Før du begynner eksperimentet, fyll en liten polystyrenskumboks med 1 L flytende nitrogen.
- Plasser to små mikrocentrifugerør (1,5 ml) i beholderen med flytende nitrogen før du starter.
MERK: Flytende nitrogen skal avkjøles utenfor rørene, men ikke være inne. Pass på å håndtere flytende nitrogen med forsiktighet og ikke utsett huden for flytende nitrogen. Bruk tang og hansker til å plassere og fjerne rør fra esken. - Legg 4-5 friske vibratomskiver i en mørtelskål.
- Hell 5-10 ml flytende N2 på toppen av skivene i mørtelskålen.
- Bruk raskt pestle til å male blitsfryseskivene i pulver før flytende nitrogen fordampes.
MERK: Vevet skal kondenseres til et fint pulver. Hvis ikke, tilsett ekstra flytende nitrogen til det er oppnådd. - Bruk en stållaboratoriumsskjeler (forhåndsbelastet med flytende nitrogen), øs pulveret inn i de to avkjølte mikrocentrifugerørene.
- Lyse pulveret ved å tilsette 500 μL RNA ekstraksjonsreagens for å fortsette med RNA-isolasjon eller 500 μL RIPA-buffer (inneholder 1x proteasehemmere) for å fortsette med proteinlys.
- Oppbevar prøvene ved -80 °C til ytterligere RNA-isolasjon, BCA-måling og vestlig flekk.
6. Bestemme levedyktighet
- Etter vibratompreparat, legg to lungeskiver i en 24-brønns kulturplate med 450 μL DMEM-medier og 50 μL celle levedyktighetsreagens (sørg for at vevet er nedsenket helt).
- Plasser prøvene tilbake i 5 % CO2 ved 37 °C inkubator over natten med minimal eksponering for lys.
- Om morgenen, observere løsningen for fargeendring. Den blå løsningen blir rosa når vevet er levedyktig.
7. Bevaring av cellemerking
- Behandle en transgen Cdh5-CreERT2 krysset med Ai14 tdTomato mus med en IP-injeksjon av Tamoxifen (2 mg/dag) i totalt 5 dager (total dose 10 mg Tamoxifen) for å indusere tdTomato etikett Cre positive celler.
- En uke etter injeksjon, forberede lungene ved hjelp av ovennevnte trinn 1 til 3.
- Etter tilberedning av den presisjonskuttede lungeskiven, plasser vevet på et mikroskopsklie og legg en deksler på toppen av vevet.
- Bruk et konfokalt mikroskop for å oppdage tdTomato-farging (ved hjelp av eksitasjonsbølgelengde 555 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når det legges til celler eller vev, endres levedyktighetsreagenset ved å redusere miljøet av levedyktig vev og blir rosa / rødt, og blir svært fluorescerende. De representative fargeendringene som oppdages fra dag 0-1 og dag 9-10, vises i figur 3. Som nevnt startet løsningen blå og ble rosa over natten, noe som viste levedyktighet. Fargeendring skjer vanligvis innen 1-4 timer. Det kan imidlertid være nødvendig med lengre tid. For å analyse for levedyktighet ble en plateleser brukt til å bestemme absorbansen av en vibratom-forberedt prøve og en 4% PFA fast lungeskive, som fungerer som en kontroll. Løsninger der prøver ble inkubert ble lest ved en absorbans på 562 nm og 630 nm etter produsentens anbefaling. Den daglige forskjellen mellom absorbans ved 562 nm og 630 nm bølgelengde for det vibratome-forberedte vevet og sammenligning med kontrollvevet er vist i figur 3.
For å demonstrere kontraktilitet av vibratom-forberedt lungevev, ble et friskt stykke vev plassert under bright field mikroskopet ved 400x og behandlet ved hjelp av KCL eller Endothelian-1 til vevet var nedsenket. En video tatt over 30-60 s av vevet avslører innsnevring av vaskulaturen (Video 1).
For å demonstrere bevaring av cellemerking 1 uke etter tamoksifeninjeksjon, ble lungeskivene oppnådd etter vibratomesnitt ved hjelp av ovennevnte protokoll observert under et konfokalt mikroskop. TdTomato-merkingen i lungeskivene er vist i figur 4.
Figur 1: Murine lungevevspreparat for vibratome-seksjonering. (A) Bobilen er kanylert med en 30G sommerfuglnål for å lette bytteløsninger fra Heparin til PBS. (B) Hele lungelober etter agarose inflasjon Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Lungeskiver med vibratome-seksjonering. Tykkelse: 300 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Levedyktighetseksperiment for PCLS-skiver fra dag 1 til dag 10. (A) Representative bilder av reagens fargeendring av PCLS-forberedt vev versus 4% PFA-fast vev. Fersk PCLS vev og 4% fast PFA vev ble plassert i 450 μL vev media og 50 μL levedyktighet reagens. Løsningsfarge i utgangspunktet lilla, som det kan ses på dag 0 og dag 9. Etter inkubering over natten endret løsningen som inneholder nylagde PCLS-vev til lilla / rosa farge (dag 1 og dag 10) på grunn av det reduserende miljøet for levende vev. (B) Kvantifisering av PCLS levedyktighet fra dag 1 til dag 10 ved forholdet mellom absorbansen ved 562 nm og 630 nm med en plateleser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Demonstrasjon av bevarte tdTomato positive celler merking etter høsting. PCLS-preparatet er fra en Cdh5-tdT transgen mus. Skalalinje = 20 μm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Innsnevring av fartøy som bruker Endothelin-1 på PCLS. Wildtype C57/B6 mus er oppblåst med 1,5 ml 1,5% agarose og seksjonert i 130 μm ved hjelp av en vibratom. Et friskt stykke vev ble plassert under bright field mikroskopet ved 400x og behandlet ved hjelp av KCL eller Endothelian-1. Forstørrelse: 400x. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskriptet beskrives en forbedret metode for å produsere høyoppløselige bilder av murin lungevev som bevarer den vaskulære strukturen og optimaliserer eksperimentell fleksibilitet, spesielt ved bruk av PCLS for å oppnå mikroslikvier av lungevev som kan ses i tre dimensjoner med bevart kontraktilitet av vaskulaturen. Ved hjelp av levedyktighetsreagensen viser protokollen at nøye forberedte og bevarte skiver kan beholde levedyktigheten i mer enn en uke. Bevart levedyktighet av mikroslikviene gjør det mulig å utføre flere og langvarige eksperimenter på vaskulatur- og luftveisstrukturer, noe som gjør det til en ideell prøve å teste ex vivo-responsen til flere stoffer, evaluere underliggende molekylære mekanismer og teste reagenser. Dette gjør forberedte prøver til den ideelle plattformen for å studere potensielle terapeutiske effekter på vaskulær tone før in vivo-studier 4. Bevaring av lunge luftveiene og vaskulaturen gjør at forberedte prøver kan behandles med ytterligere teknikker som kontraktilitetstesting beskrevet i denne artikkelen og oppsummert i tabell 1. Dette gir mulighet til å gi høyoppløselige bilder som beskriver det romlige arrangementet av lungevaskulaturen og signalkaskadene, noe som bidrar til patogenesen av lungevaskulære sykdommer.
Tilberedning av vevsmikroslikater for eksperimentering er en teknikk som bruker et vibratom, eller vibrerende blad, for å produsere presisjonskutte organotypiske skiver. Dette gir økt nøyaktighet og reproduserbarhet sammenlignet med tradisjonelle teknikker5. Mikroslices av lungene oppnådd med PCLS opprettholder den fysiologiske strukturen av lungevev til et cellulært nivå, noe som gjør det til et nyttig verktøy for å studere en rekke lungevaskulære sykdommer. Teknologien har blitt brukt i både dyre- og menneskelige modeller for å studere den komplekse lungeanatomien og lungepatologien, med et spesifikt fokus på giftige eksponeringer, smittsomme sykdommer og immunologiske studier6,7,8. Avhengig av underliggende patofysiologi, kan mikroslices oppnås av de spesifikke lober av interesse eller en / alle lober for å sammenligne sykdom heterogenitet. Skiver for tynne resulterer i vanskeligheter med å bevare strukturell integritet, mens tykkere skiver kan være vanskeligere å utføre ekstra farging eller dypt i vevsavbildning.
PCLS er spesifikk for vaskulær sykdom, og har blitt brukt til å studere pulmonal arterie hypertensjon (PAH), slik at en sofistikert modell kan analysere effekten av potensielle terapier9,10,11. Bevaring av vaskulær kontraktilitet i murin lungeprøver har mange terapeutiske og undersøkende fordeler. Ved å inkorporere en teknikk som bevarer både strukturen og kontraktiliteten til lungevaskulaturen, kan forberedte prøver modellere lungevaskulær sykdom ex vivo. Dette har blitt demonstrert tidligere av Rieg et al., som med PCLS-prøver var i stand til å demonstrere at lungeårene var mer følsomme med a1-agonister og b2-agonister, noe som tyder på at bruk av disse medisinene i venstre hjertesvikt kan forårsake økt lungeødem12. Ved å bruke denne modellen til å studere effekten av legemidler, bidrar ex vivo til å identifisere de potensielle terapeutiske midlene for mulige kliniske studier. I dette manuskriptet beskriver protokollen metoder for å håndtere og lagre vevet med levedyktighet bevart i 10 dager, slik at overvåking av vev etter potensielle intervensjoner og gir større eksperimentell fleksibilitet. Tidligere studier har brukt lignende metoder for å bevare luftveiskontraktilitet i astmamodeller, med IL-13-effekten som vedvarer i opptil 15 dager3. Immunstaining RNA og cytokiner kan føre til en bedre forståelse av den underliggende patogenesen som er ansvarlig for sykdomsprogresjon og utvikling ved ulike vaskulære sykdommer. De forberedte prøvene kan beholde cellemerking etter tilberedning, demonstrert i dette manuskriptet med bevaring av tdTomato merket Cdh5 + endotelceller. Bevaring av slik merking i vibratome forberedte prøver gjør at strukturen kan bevares sammen med cellemerking, noe som gjør det til et ideelt verktøy for å utføre cellesporingseksperimenter. Til slutt er de forberedte prøvene utsatt for videre undersøkelser som RNA lysis eller vestlig blot beskrevet i denne protokollen for å studere den underliggende patofysiologien og mekanismene som forårsaker sykdomsprogresjon.
Til tross for fordelene med andre teknikker, er det begrensninger for PCLS-forberedt vev. Å utføre PCLS gjør den dynamiske lungen til en statisk armatur, og gir et øyeblikksbilde i tide av cellene og molekylene som er tilstede i lungevev på tidspunktet for biopsi. Med mindre mange prøver er oppnådd, står det ikke for den enorme heterogeniteten som vanligvis ses i mange lungesykdommer som kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS). Vev tilberedt med PCLS er hovedsakelig begrenset til små luftveier og karsykdom. Dette skyldes de tekniske utfordringene med vevshøsting, da luftrøret vanligvis er innsnevret for lungeinflasjon og identifisering og isolering av store bronkier er utfordrende. Disse tekniske begrensningene gjør bruk av PCLS vev suboptimal for å studere større bronkier og ledende luftveier. Dynamisk testing er også begrenset, noe som gjør det til en mindre enn ideell plattform for å studere respirator-assosiert lungesykdom og barotrauma. Til slutt har anvendelsen av PCLS på pulmonologifeltet primært fokusert på murin lungevev, og videre testing og protokoller er nødvendig før de påføres menneskelig vev i et klinisk relevant scenario.
Oppsummert gir manuskriptet en komplementær metode som bevarer den vaskulære kontraktiliteten til PCLS murin lungevev, noe som resulterer i høyoppløselige bilder av lungevaskulaturen i opptil 10 dager som inneholder endogene fluorescerende celler og mange andre prosedyrer.
Tabell 1: Karakteristisk og bruk av ulike vasokonstriktorer. (*brukt i denne studien) Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Dr. Yuan Hao og Kaifeng Liu for deres tekniske støtte. Dette arbeidet ble støttet av en NIH 1R01 HL150106-01A1, Parker B. Francis Fellowship, og Pulmonary Hypertension Association Aldrighetti Research Award til Dr. Ke Yuan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
- Sparrow, D., Weiss, S. T.
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Rosales Gerpe, M. C., et al. Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liu, R., et al. Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses. Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).
- de Graaf, I. A., et al. Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).
- Alsafadi, H. N., et al. Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Springer, J., Fischer, A. Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices. The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).
- Suleiman, S., et al. Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation. Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).
- Rieg, A. D., et al. Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices. PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Deng, C. Y., et al. Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture. PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).
- Sandker, S. C., et al. Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).
- Naik, J. S., et al. Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 98 (3), Bethesda, Md. 1119-1124 (2005).
- Lopez-Lopez, J. G., et al. Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).
- Gonzalez-Tajuelo, R., et al. Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice. Arthritis & Rheumatology. 72 (3), Hoboken, N.J. 477-487 (2020).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Nishiyama, S. K., et al. Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 122 (2), Bethesda, Md. 354-360 (2017).
- Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).
- Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores. Hypertension. 29, Dallas, Tex. 222-227 (1997).
- Vecchione, C., et al. Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma. The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).
