Summary
यह प्रोटोकॉल सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति के लिए बैक्टीरियल lysate का उत्पादन करने के लिए एक तेजी से और सरल विधि का वर्णन करता है, एस्चेरिचिया कोलाई के एक इंजीनियर तनाव का उपयोग कर और केवल मानक प्रयोगशाला उपकरण की आवश्यकता होती है।
Abstract
सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति जीवित जीव की जटिलताओं के बिना जीव विज्ञान की शक्ति प्रदान करती है। हालांकि इस तरह के कई जीन अभिव्यक्ति प्रणाली मौजूद हैं, सबसे खरीदने के लिए काफी महंगे है और/या विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और पतले विशेषज्ञता के लिए प्रभावी ढंग से उत्पादन । यह प्रोटोकॉल बैक्टीरियल सेल-फ्री lysate का उत्पादन करने की एक विधि का वर्णन करता है जो जीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर का समर्थन करता है, केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके और न्यूनतम प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है। विधि एक एशेरिचिया कोलाई तनाव का उपयोग करती है जो एक एंडोलिसिन का उत्पादन करती है जो विकास को प्रभावित नहीं करती है, लेकिन जो एक साधारण फ्रीज-गल चक्र के बाद एक काटा हुआ सेल गोली को कुशलतापूर्वक lyses करती है। केवल आगे की प्रसंस्करण की आवश्यकता एक संक्षिप्त इनक्यूबेशन है जिसके बाद सेलुलर मलबे के ऑटोलिसेट को साफ करने के लिए अपकेंद्रित्र किया जाता है। संचयन से पहले कोशिकाओं में ClpX प्रोटीज़ की विषम अभिव्यक्ति के माध्यम से गतिशील जीन सर्किट प्राप्त किया जा सकता है। एक ई. कोलाई तनाव lacZ जीन की कमी उच्च संवेदनशीलता, सेल मुक्त जैव संवेदन अनुप्रयोगों के लिए एक कोलोरिमेट्रिक या फ्लोरोसेंट readout का उपयोग कर इस्तेमाल किया जा सकता है । पूरे प्रोटोकॉल के रूप में कुछ के रूप में 8-9 घंटे की आवश्यकता है, हाथ के केवल 1-2 घंटे के साथ टीका से पूरा करने के लिए श्रम पर । सेल-फ्री lysate प्राप्त करने के लिए लागत और समय को कम करके, इस विधि को विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति की सामर्थ्य में वृद्धि करनी चाहिए।
Introduction
कोशिका मुक्त लिसेट में जीन अभिव्यक्ति के जीवित कोशिकाओं का उपयोग करने के कई फायदे हैं1,2,3,4. लिसेट को आसानी से जैव रासायनिक रूप से संशोधित किया जा सकता है और उन स्थितियों में उपयोग किया जा सकता है जो जीवित कोशिकाओं में प्राप्त करने के लिए हानिकारक या असंभव हो सकती हैं। जीन अभिव्यक्ति सर्किट के लिए संघर्ष या मेजबान जैविक प्रक्रियाओं के साथ प्रतिस्पर्धा नहीं है, और नए आनुवंशिक सर्किट का परीक्षण डीएनए जोड़ने के रूप में के रूप में सरल है । इन कारणों से, सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति में बायोसेंसर5, 6से लेकर सिंथेटिक जीन सर्किट7,8 को कृत्रिम कोशिकाओं को विकसित करने के लिए विभिन्न अनुप्रयोग मिलेहैं। अधिकांश सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति सेलुलर lysates का उपयोग करती है जिन्हें अत्यधिक संसाधित किया गया है, आम तौर पर लंबे और जटिल प्रोटोकॉल, विशेष उपकरण, और/या संवेदनशील कदमों की आवश्यकता होती है जो उपयोगकर्ताओं और बैचों10, 11के बीच महत्वपूर्ण भिन्नता पैदा कर सकते हैं ।
यह पत्र सेल-फ्री lysate के उत्पादन के लिए एक सरल, कुशल विधि का वर्णन करता है जिसके लिए न्यूनतम प्रसंस्करण और विशेषज्ञता(चित्रा 1A)12की आवश्यकता होती है। विधि ई. कोलाई कोशिकाओं पर निर्भर करती है जो एक साधारण फ्रीज-गल चक्र के बाद lyse करने के लिए इंजीनियर हैं। कोशिकाएं फेज लैम्ब्डा से एक एंडोलिसिन व्यक्त करती हैं जो कोशिका की दीवार को नीचा दिखाती है। जैसे-जैसे कोशिकाएं बढ़ रही हैं, यह एंडोलिसिन साइटोप्लाज्म में रहता है, जो सेल की दीवार से तनहा होता है। हालांकि, एक साधारण फ्रीज-गल चक्र साइटोप्लाज्मिक झिल्ली को बाधित करता है, एंडोलिसिन को पेरिप्लाज्म में जारी करता है, जहां यह कोशिका की दीवार को कम करता है, जिसके परिणामस्वरूप तेजी से सेल लाइसिस होता है। प्रोटोकॉल को केवल कुछ घंटों के काम के साथ पूरा किया जा सकता है और केवल एक फ्रीजर, 30,000 × जी में सक्षम एक अपकेंद्रित्र (इष्टतम परिणामों के लिए; कम गति का उपयोग अधिक देखभाल के साथ किया जा सकता है गोली को परेशान न करने के लिए), एक भंवर मिक्सर, और एक सरल बफर समाधान। कार्यात्मक रूप से भी कोशिकाओं को फ्रीज-सुखाने और उन्हें सीटू मेंफिर से हाइड्रेटिंग करके उत्पादित किया जा सकता है। हालांकि, यह विधि कम गतिविधि के साथ lysates पैदा करती है, संभवतः शेष सेल मलबे के कारण।
lysates सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति के लिए अत्यधिक सक्रिय हैं, और वे अंत उपयोग के आधार पर विभिन्न तरीकों से बढ़ाया जा सकता है। मानक स्पिन सांती का उपयोग करके लाइसेट को केंद्रित करके प्रोटीन संश्लेषण की दर को और बढ़ाया जा सकता है। लिनेर डीएनए को शुद्ध गम्स प्रोटीन जोड़कर गिरावट से बचाया जा सकता है। प्रोटीन क्षरण, आदोलन जैसे अधिक जटिल सर्किट गतिशीलता के लिए आवश्यक, ऑटोलिसेट-उत्पादक तनाव13में एक ClpX हेक्सामर को सह-व्यक्त करके प्राप्त किया जा सकता है। अंत में, लैक्ज़-आधारित दृश्य रीडआउट को लैक्ज़की कमी वाले ऑटोलिस्रेट तनाव का उपयोग करके सक्षम किया जाता है। कुल मिलाकर, यह विधि अत्यधिक सक्रिय सेल-फ्री lysate का उत्पादन करती है जो विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है।
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Protocol
1. मीडिया और बफ़र्स तैयार करें।
- 2xYTPG माध्यम तैयार करें।
- 62 ग्राम 2xYT पाउडर, 5.99 ग्राम पोटेशियम फॉस्फेट मोनोबेसिक, 13.93 ग्राम पोटेशियम फॉस्फेट डिबेसिक, और 2 एल करने के लिए deionized पानी मिलाएं।
- 30 मिनट14के एक्सपोजर समय के साथ तरल चक्र पर ऑटोक्लेव ।
- 1.1.2 से 2xYTP मीडिया के 400 मिलीएल तक, 7.2 ग्राम डी-ग्लूकोज (डेक्सट्रोस) जोड़ें और भंग होने तक मिलाएं।
- 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर-स्टरलाइज करें।
- S30A बफर तैयार करें।
- मिक्स ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.7, 50 mm अंतिम एकाग्रता), पोटेशियम ग्लूटामेट (60 m M फाइनल), और मैग्नीशियम ग्लूटामेट (14 mM फाइनल)।
- 10 एम कोह का उपयोग करके पीएच को 7.7 पर समायोजित करें।
- समाधान 1 तैयार करें (तालिका 1देखें)।
- 4-(2-हाइड्रोक्सीथिल) -1- 2 मिलील पानी में पिपरेजिएथानसुल्फोनिक एसिड (एचईपीईएस) ।
- कोह का उपयोग करके पीएच को 8.0 पर समायोजित करें।
- तालिका 1से अन्य सभी घटकों को जोड़ें।
- 10 एम कोह का उपयोग करके पीएच को 7.6 पर समायोजित करें। फ़िल्टर-स्टरलाइज करें।
- 2.5x प्रीमिक्स समाधान तैयार करें (तालिका 2देखें)।
- तालिका 2में सभी घटकों को मिलाएं।
- कोह का उपयोग करके पीएच को 7.5 पर समायोजित करें।
- Aliquot और -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज।
नोट: एक 20 माइक्रोन प्रतिक्रिया प्रीमिक्स के 8.9 माइक्रोन का उपयोग करता है।
2. कोशिकाओं को तैयार करें।
- एक इनोकुलेट लूप का उपयोग करके 50 μg/mL एम्पिसिलिन युक्त एलबी एगर प्लेटों पर ऑटोलैसेट कोशिकाओं को लकीर दें और 37 डिग्री सेल्सियस से बढ़ें (नोट 1 देखें)।
- एक पिपेट टिप का उपयोग करके एलबी/एम्प्सिलिन माध्यम की स्टार्टर संस्कृति में एक कॉलोनी चुनें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस से आगे बढ़ें।
- 2xYTPG माध्यम के 400 मिलियन एमआईएल को 400 माइक्रोन के साथ स्टार्टर कल्चर के 400 माइक्रोन के साथ टीका लगाते हैं, और 300 आरपीएम पर मिलाते हुए 1 एल एर्लेनमेयर फ्लास्क में 37 डिग्री सेल्सियस से आगे बढ़ते हैं।
- समय-समय पर 1 सेमी पथ लंबाई के साथ ऑप्टिकल क्यूवेट पढ़ने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 600 एनएम (ओडी600)पर संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व को मापें। जब ओडी600 1 से अधिक हो जाती है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए माप से पहले संस्कृति को 5 गुना कमजोर करना शुरू करें कि माप एक विशिष्ट प्रयोगशाला स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की रैखिक सीमा के भीतर रहें। कोशिकाओं को तब तक बढ़ाना जारी रखें जब तक कि 5 गुना पतला संस्कृति0.3 के ओडी 600 तक न पहुंच जाए (1.5 की संस्कृति ओडी600 के अनुरूप)।
3. lysate तैयार करें।
- 2 m dithiothreitol (DTT) के साथ पूरक S30A बफर तैयार करें। चरण 3.7 में उपयोग के लिए बर्फ पर 1 एम प्लेस पर डीटीटी स्टॉक समाधान के 6 μL के साथ S30A बफर के 3 एमएल मिलाएं।
- कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 1800 × जी पर अपकेंद्री द्वारा कोशिकाओं को फसल।
- सुपरनेट को इसे बंद करके और किसी भी शेष तरल को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करके त्यागें।
- एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर ठंड (4-10 डिग्री सेल्सियस) S30A बफर के 45 एमएल में गोली को फिर से खर्च करें।
- एक खाली 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब का वजन करें, कोशिकाओं को इसमें स्थानांतरित करें, और कोशिकाओं को धोने के लिए चरण 3.2-3.3 दोहराएं।
- गोली का वजन करें, एक खाली 50 एमएल ट्यूब का वजन घटाएं। पैलेट वजन का सटीक माप सुनिश्चित करने के लिए किसी भी शेष सुपरनाट को सावधानीपूर्वक आकांक्षी करना सुनिश्चित करें।
नोट: एक विशिष्ट उपज उत्पादन संस्कृति के 400 एमएल से सेल पेलेट का ~ 1.3 ग्राम है। - 2 m dithiothreitol के साथ पूरक ठंड S30A बफर के 2 संस्करणों जोड़ें, यानी, सेल गोली के हर 1 ग्राम के लिए बफर के 2 मिलीएल, और तेजी से भंवर मिश्रण द्वारा कोशिकाओं को फिर से खर्च ।
- कोशिकाओं को फ्रीज करें। 50 एमएल ट्यूब जिसमें कोशिकाओं को -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें जब तक कि गोली पूरी तरह से जम न जाए।
नोट: ठंड कदम दिन के लिए एक अच्छा रोक बिंदु है । - एक कमरे के तापमान पानी स्नान में कोशिकाओं गल।
- भंवर 2-3 मिनट के लिए सख्ती से।
- 300 आरपीएम पर मिलाते हुए 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 30,000 × जी पर पारदर्शी अपकेंद्रित्र ट्यूबों में अपकेंद्रित्र द्वारा भारी सेलुलर मलबे के नमूने को साफ करें।
नोट: यदि 30,000 x g में सक्षम एक अपकेंद्रित्र उपलब्ध नहीं है, तो 21,000 × जीपर 45 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, और चरण 3.13 में अतिरिक्त सावधानी का उपयोग करें, क्योंकि गोली कम कॉम्पैक्ट होगी। - जितना संभव हो गोली को परेशान करने से बचें, एक पिपेट के साथ एक नई ट्यूब में सुपरनैंट को सावधानी से स्थानांतरित करें। यदि स्थानांतरित सुपरनेट पैलेट को गोली से सामग्री से दूषित करता है, तो पिछले चरण को दोहराएं।
- सुपरनेट को 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब और सेंट्रलाइज में एक बार फिर 21,000 × जी (या टेबलटॉप सेंट्रलाइज की अधिकतम गति) को 5 मिनट के लिए स्थानांतरित करें।
- एलिकोट वांछित मात्रा में स्वीकृत ऑटोलिट करें, ध्यान से किसी भी शेष गोली से बचें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें या तुरंत उपयोग करें।
नोट: एक 20 माइक्रोन प्रतिक्रिया ऑटोलिसेट के 8 माइक्रोन का उपयोग करता है।
4. सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति
नोट: ऑटोलिस्टेट अब किसी भी वांछित अंतिम उपयोग के लिए तैयार है। निम्नलिखित सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति के लिए एक उदाहरण मानक प्रोटोकॉल है।
- 20 माइक्रोल प्रतिक्रिया के लिए, बर्फ पर मिश्रण 8 माइक्रोन ऑटोलिस्टेट और 8.9 माइक्रोन प्रीमिक्स। मैग्नीशियम ग्लूटामेट और खूंटी 8000 सांद्रता के अनुकूलन के बारे में प्रोटोकॉल अनुभाग के अंत में नोट देखें।
- डीएनए जोड़ें (जैसे, pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 8 एनएम की अंतिम एकाग्रता के लिए), किसी भी अंय अभिकर्मक, और 20 μL के लिए पानी ।
- एक ३८४-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट में प्रतिक्रिया रखें और फ्लोरेसेंस समय पाठ्यक्रम और/या अंत बिंदुओं को एक प्लेट रीडर का उपयोग कर उपाय । ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के लिए, 485 एनएम की एक्सट्रवेंशन वेवलेथ और 520 एनएम की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करें।
5. प्रोटोकॉल संशोधन
नोट: प्रोटोकॉल के निम्नलिखित संशोधन इसे अन्य अनुप्रयोगों की सेवा करने में सक्षम बनाते हैं।
- लीनियर डीएनए टेम्पलेट्स का उपयोग करके सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति
- धारा 4 में चरणों का प्रदर्शन करें, 2.2 माइक्रोन शुद्ध गम्स प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया को पूरक करें (रैखिक डीएनए के अलावा से पहले12वर्णित और शुद्ध और शुद्ध) ।
- प्रोटीन क्षरण को शामिल करते हुए सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति
- चरण 2.1 में, प्लाज्मिड पीएसवाईसी-फ्लैग-डीएन6-उसके (सामग्री की तालिकादेखें) युक्त ऑटोलाइट कोशिकाओं का उपयोग करें। सभी विकास मीडिया में, इसके अतिरिक्त 34 μg/एमएल क्लोराम्फेनिकोल शामिल हैं।
- स्टेप 2.3 में प्लाज्मिड से अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए विकास माध्यम में 40 माइक्रोन आइसोप्रोपिल β-डी-1-थिओगलाटॉपाइरानोसाइड (आईपीटीजी) शामिल हैं।
- क्लोरम्फेनिकोल को पूरी तरह से हटाने को सुनिश्चित करने के लिए दो अतिरिक्त बार (कुल तीन वॉश) दो अतिरिक्त बार (धोने) के चरणों को दोहराएं, जो एक अनुवाद अवरोधक है। पहले दो वॉश (चरण 3.4) के लिए, फास्फेट-बफर नमकीन (पीएच 7.4) के साथ स्थानापन्न S30A बफर।
- चरण 4.2 में, अतिरिक्त 3 एमएमएम एटीपी के साथ पूरक (पानी में 100 mm एटीपी के स्टॉक समाधान से जोड़ा गया, पीएच 7.2) और 4.5 मीटर मैग्नीशियम ग्लूटामेट (पानी में 1 एम स्टॉक समाधान का उपयोग करना) (अंतिम सांद्रता) सीएलपीएक्सपी द्वारा उच्च एटीपी उपयोग के साथ-साथ अतिरिक्त एटीपी द्वारा मैग्नीशियम के चेलेशन की भरपाई करने के लिए।
- लैक्ज़-आधारित रीडआउट (कोलोरिमेट्रिक सहित) का उपयोग करके सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति
- चरण 2.1 में, ऑटोलिसेट कोशिकाओं का उपयोग करें जो मूल रूप से लैक्ज़ व्यक्त नहीं करते हैं (सामग्री की तालिकादेखें)।
- वैकल्पिक रूप से, सीधे फ्रीज-सूखे कोशिकाओं से lysate तैयार करें।
- 1.1 से 3.7 तक सभी चरणों को करें।
- प्रीमिक्स के 8.9 माइक्रोन के साथ सेल सस्पेंशन के 8 माइक्रोन मिलाएं।
- प्लाज्मिड डीएनए (यदि वांछित हो), अन्य कस्टम रिएजेंट्स और पानी को 20 माइक्रोन की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए जोड़ें।
- प्रतिक्रिया को 384-वेल माइक्रोप्लेट पर स्थानांतरित करें और इसे फ्रीज-सूखा करें।
नोट: फ्रीज-सूखे नमूनों को एक सप्ताह तक और संभवतः लंबे समय तक संग्रहीत किया जा सकता है। - प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए, इसे किसी भी वांछित डीएनए या अन्य अभिकर्णों के साथ पूरक डिएकोन्ड पानी के 18 माइक्रोन के साथ फिर से हाइड्रेट करें।
- एक प्लेट रीडर में फ्लोरेसेंस गतिशीलता का पालन करें।
नोट 1: ऑटोलैस्टेट कोशिकाओं को फ्रीज-गल चक्र पर lyse करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, इसलिए जमे हुए स्टॉक बनाते समय क्रायोप्रोटेक्टेंट का उपयोग करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। हमने स्टॉक्स को 24% wt/vol ग्लिसेरोल में सील किया और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया ।
नोट 2: मैग्नीशियम आयनों और खूंटी 8000 lysate प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण हैं. पहले प्रकाशित आंकड़ों के आधार पर आधार 2.5x प्रीमिक्स में 6 एमएम मैग्नीशियम ग्लूटामेट और ४.८% wt/vol PEG ८००० होता है, जो अंतिम प्रतिक्रिया में क्रमशः २.४ mm और १.९% हो जाता है । यहां प्रोटोकॉल के साथ तैयार ऑटोलिसेट आमतौर पर अंतिम प्रतिक्रिया में अतिरिक्त 5 एमएम एमजी-ग्लूटामेट और 1.5% खूंटी 8000 के साथ सबसे अच्छा प्रदर्शन करता है। हालांकि, इसे अतिरिक्त 0-10 mMg एमजी ग्लूटामेट और अतिरिक्त 0-3% खूंटी 8000 (आधार प्रीमिक्स की तुलना में) की सीमा में अनुकूलित किया जा सकता है। अनुशंसित अतिरिक्त 5 m Mg-ग्लूटामेट और 1.5% खूंटी 8000 (अंतिम सांद्रता) के साथ प्रीमिक्स तैयार करने के लिए, 1 एम पर मैग्नीशियम ग्लूटामेट के 4.75 माइक्रोन के साथ प्रीमिक्स के 380 माइक्रोन और 40% वजन/मात्रा में खूंटी 8000 के 36.1 माइक्रोन के साथ मिश्रण करें।
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Representative Results
प्रतिनिधि परिणाम एक संविलियन व्यक्त प्लाज्मिड से GFP व्यक्त करने के लिए ऑटोलाइट का उपयोग करके देखा जा सकता है, यहां pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, और एक प्लेट रीडर(चित्रा 1B)में GFP फ्लोरेसेंस का एक समय पाठ्यक्रम रिकॉर्डिंग । प्लाज्मिड डीएनए की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला में 1 एनएम डीएनए में भी मजबूत अभिव्यक्ति पाई गई । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध lysate की तुलना में, ऑटोलिसेट अधिक कुल उपज का उत्पादन कर सकता है और अधिक से अधिक अधिकतम उत्पादन दर प्राप्त कर सकता है, जो जीएफपी समय पाठ्यक्रम(चित्र 1सी,डी)के समय व्युत्पन्न के रूप में गणना की जाती है। इस विधि का उपयोग कर अतिरिक्त परिणामों के लिए, Didovyk एट अल12देखें । इस प्रोटोकॉल में अपेक्षाकृत कुछ विफलता अंक हैं; हालांकि, यदि ऑटोलिसेट को सेल मलबे से पर्याप्त रूप से मंजूरी नहीं दी जाती है तो उप-ोप्टिमल परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं। इष्टतम परिणामों के लिए हर बैच के लिए खूंटी-8000 और एमजी2 + की सांद्रता को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है (नोट 2 देखें)।
चित्र 1:प्रतिनिधि परिणाम। (A)प्रोटोकॉल का दृश्य प्रतिनिधित्व । (ख)एक फ्रीज-गल ऑटोलिसेट में pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1-deGFP-T500 से जीएफपी अभिव्यक्ति का उदाहरण समय पाठ्यक्रम । एमवाय सेएक वाणिज्यिक संदर्भ lysate (नारंगी, MYtlxt-70-96M) की तुलना में 2 विभिन्न शोधकर्ताओं द्वारा 2 विभिन्न प्रयोगशालाओं में तैयार ऑटोलिसेट की अधिकतम जीएफपी उत्पादन (सी) और अधिकतम उत्पादन दर(डी),30,000 एक्स जीजी सेंट्रलाइज (ब्लू और ऑरेंज) या 20,000 एक्स जीजी सेंट्रलाइज (बैंगनी) का उपयोग करके। सभी त्रुटि सलाखों का मतलब दो तकनीकी प्रतिकृति की पूर्ण त्रुटि है। इस आंकड़े को 12से संशोधित किया गया है । कॉपीराइट 2017 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। संक्षिप्त नाम: GFP = हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| समाधान 1: कुल 4 एमएल में पानी जोड़ें | |
| नाम | वजन (मिलीग्राम) |
| 3-पीजीए | 386.4 |
| एटीपी | 52 |
| शिविर | 13.8 |
| सीओए | 11.2 |
| सीटीपी | 28.4 |
| फोलिक एसिड | 1.9 |
| जीटीपी | 47.6 |
| हेपेस | 667.2 |
| एनएडी | 12.3 |
| शुक्राणुनाशक | 8.1 |
| ट्रान्सटास | 11.2 |
| यूटीपी | 29.5 |
तालिका 1: समाधान 1। समाधान के घटक 1.
| 2.5x प्रीमिक्स | |
| अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) | वॉल्यूम (माइक्रोन) |
| अमीनो एसिड मिश्रण जिसमें 24 mm प्रत्येक होता है, ल्यूसिन को छोड़कर जो 20 mM पर है | 2500 |
| 100 mm पर डिइयोट्रेटॉल (डीटीटी) | 100 |
| 1 मीटर पर मैग्नीशियम ग्लूटामेट | 25 |
| खूंटी-8000 पर 40% wt/vol | 500 |
| 2 मीटर पर पोटेशियम ग्लूटामेट | 303 |
| समाधान 1 (तालिका 1 देखें) | 714.3 |
तालिका 2: प्रीमिक्स। प्रीमिक्स समाधान के घटक।
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Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति के लिए अत्यधिक सक्रिय बैक्टीरियल lysate पैदा करता है। कुंजी प्लाज्मिड पीएड-LyseR को ले जाने वाली कोशिकाओं का उपयोग करना है, जो लैम्ब्डा फेज एंडोलिसिन साइटोसोलिक रूप से व्यक्त करता है। इन कोशिकाओं को आंतरिक झिल्ली के पारलौका पर खुद को lyse करने के लिए शक्तिशाली हैं, जिससे सेल दीवार तक एंडोलिसिन पहुंच की अनुमति होती है, जिसे विधि एक साधारण फ्रीज-गल चक्र के माध्यम से प्राप्त करती है। क्योंकि कोशिकाएं प्रभावी रूप से खुद को lyse करती हैं, उत्पाद को ऑटोलिस्टेट के रूप में जाना जाता है। कोशिकाओं के lysed के बाद, केवल शेष कदम इनक्यूबेशन और सेलुलर मलबे के ऑटोलिसेटिंग को साफ करने के लिए अपकेंद्रित्र कर रहे हैं ।
बैक्टीरियल lysate के उत्पादन के लिए अन्य तरीकों की तुलना में, यह दृष्टिकोण विशेष रूप से सरल और तेजी से है, फिर भी यह lysate की गुणवत्ता का बलिदान नहीं करता है। प्रोटोकॉल को उत्पादन संस्कृति को फिर से तैयार करने के बाद 8-9 घंटे में पूरा किया जा सकता है, जिसमें केवल 1-2 घंटे के हाथों से श्रम होता है। आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए पूरी तरह से मानक नहीं है कि उपकरणों का एकमात्र अनुशंसित टुकड़ा 30,000 × जी प्राप्त करने में सक्षम एक अपकेंद्रित्र है। हालांकि, तुलनात्मक गुणवत्ता के ऑटोलिज़ेट का उत्पादन कम गति वाले अपकेंद्रित्र(चित्रा 1C,D) के साथ भी किया जा सकता है; उपयोगकर्ता को सिर्फ गोली से lysate को हटाने के लिए और अधिक सावधान रहना होगा, शायद साफ नमूनों को सुनिश्चित करने के लिए थोड़ा और अधिक तरल पीछे छोड़ । यह सादगी केवल सुविधा की बात नहीं है; कम जटिल प्रोटोकॉल विभिन्न हाथों से किए जाने पर कम भिन्नता के साथ अधिक प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करते हैं। चरण 5.4 में प्रस्तुत संशोधन, जिसमें कोशिकाओं को अन्य सभी अभिकर्षकों के साथ फ्रीज-सूखा किया जाता है, एक और भी सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, हालांकि कम प्रोटीन उत्पादन पैदावार के साथ। विशेष रूप से, इस संशोधन में, सेलुलर मलबे के lysate को साफ करने के लिए अपकेंद्रित्र कदम छोड़ दिए जाते हैं, जो प्रसंस्करण श्रम को और कम कर देते हैं; हालांकि, शेष मलबे lysate12से अभिव्यक्ति कम कर देता है .
हाल के वर्षों में, सेल मुक्त lysate उत्पादन के लिए कई दृष्टिकोण प्रकाशित किया गया है, हाल ही में कोल एट अल द्वारा संक्षेप ।15। इन अध्ययनों ने सेल प्रकार, विकास की स्थिति, लाइसिस पद्धतियों और प्रसंस्करण के बाद के लिए विभिन्न रणनीतियों का पता लगाया है। लाइसिस के लिए अधिकांश अन्य तरीकों में फ्रांसीसी प्रेस, होमोजेनाइजर, मनका डिब्बा, या सोनिकेटर जैसे विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। फुजिवारा और दोई ने इस उपकरण को यहां वर्णित एक फ्रीज-गल चक्र के पक्ष में छोड़ दिया, सिवाय इसके कि उन्होंने एंडोलिसिन16व्यक्त करने के बजाय लाइसोजाइम के साथ उनका इलाज करके लाइसिस के लिए अतिसंवेदनशील कोशिकाओं को प्रदान किया। हालांकि यह मोटे तौर पर सरल एक प्रोटोकॉल के रूप में एक यहां वर्णित है, lysozyme इलाज कोशिकाओं को धोया जाना चाहिए, जबकि उंहें समय से पहले बाधित किए बिना उनकी नाजुक स्थिति में है, जो प्रयोगात्मक चालाकी की आवश्यकता है और परिवर्तनशीलता का एक स्रोत शुरू कर सकता है ।
lysate के अलावा, सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति ऊर्जा स्रोतों, आरएनए और प्रोटीन मोनोमर, और अन्य छोटे अणुओं युक्त एक प्रीमिक्स समाधान की आवश्यकता है। प्रीमिक्स नुस्खा कुछ संशोधनों के साथ पहले17वर्णित और अनुकूलित किया गया था। यहां उपयोग किए जाने वाले प्रीमिक्स में अमीनो एसिड की लगभग 4 गुना अधिक सांद्रता, साथ ही अतिरिक्त मैग्नीशियम ग्लूटामेट और खूंटी 8000 क्रमशः 7.5 m m और 3.5% वजन/मात्रा की अंतिम प्रतिक्रिया सांद्रता के अनुरूप थे। इष्टतम परिणामों के लिए प्रत्येक नए बैच के लिए पूरक मैग्नीशियम ग्लूटामेट और खूंटी 8000 सांद्रता को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है, हालांकि उपरोक्त सांद्रता ने लगातार अच्छे परिणाम पेश किए (नोट 2 देखें)। उदाहरण के लिए, सीएलपीएक्स-सप्लीमेंट वाले13का उपयोग करते समय अद्वितीय अनुप्रयोगों को इन सांद्रता को फिर से प्रचारित करने की आवश्यकता हो सकती है।
सेल-फ्री lysate के उत्पादन के लिए एक मानक ई. कोलाई तनाव BL21-गोल्ड (DE3) है । ऑटोलिसिस प्लाज्मिड पीएडी-लाइसेआर युक्त इन कोशिकाओं का एक व्युत्पन्न एक तनाव और प्लाज्मिड भंडार (सामग्री की तालिकादेखें) में जमा किया गया है। इसके अलावा उपलब्ध एक व्युत्पन्न जीनोमिक lacZ की कमी को नाटकीय रूप से सर्किट के लिए पृष्ठभूमि को कम करने के लिए है कि LacZ आधारित उत्पादन और एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड PAD-GamS का उपयोग करने के लिए GamS प्रोटीन है कि गिरावट से रैखिक डीएनए की रक्षा कर सकते है की शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । ये कोशिका उपभेदों और प्लाज्मिड सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति में अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए उपयोगी होना चाहिए।
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Disclosures
जेएच GenCirq इंक के सह-संस्थापक हैं, जो कैंसर चिकित्सा विज्ञान पर ध्यान केंद्रित करते हैं । वह निदेशक मंडल में हैं और जेनसिरक्यू में इक्विटी है ।
Acknowledgments
लेखकों जचारी सूर्य और रिचर्ड मरे (कैलिफोर्निया प्रौद्योगिकी संस्थान) कृपया प्लाज्मिड P_araBAD-gams प्रदान करने के लिए धंयवाद, और Kaeko Kamei (क्योटो प्रौद्योगिकी संस्थान) कृपया एक उच्च गति ठंडा अपकेंद्रित्र प्रदान करने के लिए । इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों और एआरओ मुरी कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था और आंशिक रूप से उत्कृष्ट युवा शोधकर्ताओं, MEXT, जापान के लिए अग्रणी पहल द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
- Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
- Pardee, K., et al.
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
- Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard". ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
- Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
- Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
