बैक्टीरियल सेल-फ्री Lysate का रैपिड, किफायती और सीधी उत्पादन
Summary
यह प्रोटोकॉल सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति के लिए बैक्टीरियल lysate का उत्पादन करने के लिए एक तेजी से और सरल विधि का वर्णन करता है, एस्चेरिचिया कोलाई के एक इंजीनियर तनाव का उपयोग कर और केवल मानक प्रयोगशाला उपकरण की आवश्यकता होती है।
Abstract
सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति जीवित जीव की जटिलताओं के बिना जीव विज्ञान की शक्ति प्रदान करती है। हालांकि इस तरह के कई जीन अभिव्यक्ति प्रणाली मौजूद हैं, सबसे खरीदने के लिए काफी महंगे है और/या विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और पतले विशेषज्ञता के लिए प्रभावी ढंग से उत्पादन । यह प्रोटोकॉल बैक्टीरियल सेल-फ्री lysate का उत्पादन करने की एक विधि का वर्णन करता है जो जीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर का समर्थन करता है, केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके और न्यूनतम प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है। विधि एक एशेरिचिया कोलाई तनाव का उपयोग करती है जो एक एंडोलिसिन का उत्पादन करती है जो विकास को प्रभावित नहीं करती है, लेकिन जो एक साधारण फ्रीज-गल चक्र के बाद एक काटा हुआ सेल गोली को कुशलतापूर्वक lyses करती है। केवल आगे की प्रसंस्करण की आवश्यकता एक संक्षिप्त इनक्यूबेशन है जिसके बाद सेलुलर मलबे के ऑटोलिसेट को साफ करने के लिए अपकेंद्रित्र किया जाता है। संचयन से पहले कोशिकाओं में ClpX प्रोटीज़ की विषम अभिव्यक्ति के माध्यम से गतिशील जीन सर्किट प्राप्त किया जा सकता है। एक ई. कोलाई तनाव lacZ जीन की कमी उच्च संवेदनशीलता, सेल मुक्त जैव संवेदन अनुप्रयोगों के लिए एक कोलोरिमेट्रिक या फ्लोरोसेंट readout का उपयोग कर इस्तेमाल किया जा सकता है । पूरे प्रोटोकॉल के रूप में कुछ के रूप में 8-9 घंटे की आवश्यकता है, हाथ के केवल 1-2 घंटे के साथ टीका से पूरा करने के लिए श्रम पर । सेल-फ्री lysate प्राप्त करने के लिए लागत और समय को कम करके, इस विधि को विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति की सामर्थ्य में वृद्धि करनी चाहिए।
Introduction
कोशिका मुक्त लिसेट में जीन अभिव्यक्ति के जीवित कोशिकाओं का उपयोग करने के कई फायदे हैं1,2,3,4. लिसेट को आसानी से जैव रासायनिक रूप से संशोधित किया जा सकता है और उन स्थितियों में उपयोग किया जा सकता है जो जीवित कोशिकाओं में प्राप्त करने के लिए हानिकारक या असंभव हो सकती हैं। जीन अभिव्यक्ति सर्किट के लिए संघर्ष या मेजबान जैविक प्रक्रियाओं के साथ प्रतिस्पर्धा नहीं है, और नए आनुवंशिक सर्किट का परीक्षण डीएनए जोड़ने के रूप में के रूप में सरल है । इन कारणों से, सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति में बायोसेंसर5, 6से लेकर सिंथेटिक जीन सर्किट7,8 को कृत्रिम कोशिकाओं को विकसित करने के लिए विभिन्न अनुप्रयोग मिलेहैं। अधिकांश सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति सेलुलर lysates का उपयोग करती है जिन्हें अत्यधिक संसाधित किया गया है, आम तौर पर लंबे और जटिल प्रोटोकॉल, विशेष उपकरण, और/या संवेदनशील कदमों की आवश्यकता होती है जो उपयोगकर्ताओं और बैचों10, 11के बीच महत्वपूर्ण भिन्नता पैदा कर सकते हैं ।
यह पत्र सेल-फ्री lysate के उत्पादन के लिए एक सरल, कुशल विधि का वर्णन करता है जिसके लिए न्यूनतम प्रसंस्करण और विशेषज्ञता(चित्रा 1A)12की आवश्यकता होती है। विधि ई. कोलाई कोशिकाओं पर निर्भर करती है जो एक साधारण फ्रीज-गल चक्र के बाद lyse करने के लिए इंजीनियर हैं। कोशिकाएं फेज लैम्ब्डा से एक एंडोलिसिन व्यक्त करती हैं जो कोशिका की दीवार को नीचा दिखाती है। जैसे-जैसे कोशिकाएं बढ़ रही हैं, यह एंडोलिसिन साइटोप्लाज्म में रहता है, जो सेल की दीवार से तनहा होता है। हालांकि, एक साधारण फ्रीज-गल चक्र साइटोप्लाज्मिक झिल्ली को बाधित करता है, एंडोलिसिन को पेरिप्लाज्म में जारी करता है, जहां यह कोशिका की दीवार को कम करता है, जिसके परिणामस्वरूप तेजी से सेल लाइसिस होता है। प्रोटोकॉल को केवल कुछ घंटों के काम के साथ पूरा किया जा सकता है और केवल एक फ्रीजर, 30,000 × जी में सक्षम एक अपकेंद्रित्र (इष्टतम परिणामों के लिए; कम गति का उपयोग अधिक देखभाल के साथ किया जा सकता है गोली को परेशान न करने के लिए), एक भंवर मिक्सर, और एक सरल बफर समाधान। कार्यात्मक रूप से भी कोशिकाओं को फ्रीज-सुखाने और उन्हें सीटू मेंफिर से हाइड्रेटिंग करके उत्पादित किया जा सकता है। हालांकि, यह विधि कम गतिविधि के साथ lysates पैदा करती है, संभवतः शेष सेल मलबे के कारण।
lysates सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति के लिए अत्यधिक सक्रिय हैं, और वे अंत उपयोग के आधार पर विभिन्न तरीकों से बढ़ाया जा सकता है। मानक स्पिन सांती का उपयोग करके लाइसेट को केंद्रित करके प्रोटीन संश्लेषण की दर को और बढ़ाया जा सकता है। लिनेर डीएनए को शुद्ध गम्स प्रोटीन जोड़कर गिरावट से बचाया जा सकता है। प्रोटीन क्षरण, आदोलन जैसे अधिक जटिल सर्किट गतिशीलता के लिए आवश्यक, ऑटोलिसेट-उत्पादक तनाव13में एक ClpX हेक्सामर को सह-व्यक्त करके प्राप्त किया जा सकता है। अंत में, लैक्ज़-आधारित दृश्य रीडआउट को लैक्ज़की कमी वाले ऑटोलिस्रेट तनाव का उपयोग करके सक्षम किया जाता है। कुल मिलाकर, यह विधि अत्यधिक सक्रिय सेल-फ्री lysate का उत्पादन करती है जो विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति के लिए अत्यधिक सक्रिय बैक्टीरियल lysate पैदा करता है। कुंजी प्लाज्मिड पीएड-LyseR को ले जाने वाली कोशिकाओं का उपयोग करना है, जो लैम्ब्डा फेज एंडोलिसिन साइटोसोल?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों जचारी सूर्य और रिचर्ड मरे (कैलिफोर्निया प्रौद्योगिकी संस्थान) कृपया प्लाज्मिड P_araBAD-gams प्रदान करने के लिए धंयवाद, और Kaeko Kamei (क्योटो प्रौद्योगिकी संस्थान) कृपया एक उच्च गति ठंडा अपकेंद्रित्र प्रदान करने के लिए । इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों और एआरओ मुरी कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था और आंशिक रूप से उत्कृष्ट युवा शोधकर्ताओं, MEXT, जापान के लिए अग्रणी पहल द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
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