ייצור מהיר, זול ולא מסובך של ליסאט נטול תאים חיידקי
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה ופשוטה לייצור ליסאט חיידקי לביטוי גנים ללא תאים, באמצעות זן מהונדס של Escherichia coli ודורש ציוד מעבדה סטנדרטי בלבד.
Abstract
ביטוי גנים ללא תאים מציע את כוחה של הביולוגיה ללא סיבוכים של אורגניזם חי. למרות שקיימות מערכות ביטוי גנים רבות כאלה, רובן יקרות למדי לקנייה ו/או לדרוש ציוד מיוחד ומומחיות מושחזת דק כדי לייצר ביעילות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור ליסאט נטול תאים חיידקי התומך ברמות גבוהות של ביטוי גנים, תוך שימוש בציוד מעבדה סטנדרטי בלבד ודורש עיבוד מינימלי. השיטה משתמשת בזן קולי Escherichia המייצר אנדוליסין שאינו משפיע על הצמיחה, אך מייצר ביעילות גלולה של תאים שנקטפו לאחר מחזור פשוט של הפשרת הקפאה. העיבוד הנוסף היחיד הנדרש הוא דגירה קצרה ואחריה צנטריפוגה כדי לנקות את האוטוליקט של פסולת הסלולר. מעגלי גנים דינמיים יכולים להיות מושגים באמצעות ביטוי הטרולוגי של פרוטאז ClpX בתאים לפני הקציר. זן E. coli חסר הגן lacZ יכול לשמש עבור רגישות גבוהה, יישומי biosensing ללא תאים באמצעות קריאה צבעונית או פלואורסצנטית. הפרוטוקול כולו דורש מעט כמו 8-9 שעות, עם רק 1-2 שעות של עבודה מעשית מחיסון להשלמה. על ידי הפחתת העלות והזמן כדי לקבל lysate ללא תאים, שיטה זו צריכה להגדיל את המחיר הזול של ביטוי גנים ללא תאים עבור יישומים שונים.
Introduction
ביטוי גנים בליסאטים ללא תאים יש מספר יתרונות על פני שימוש בתאים חיים1,2,3,4. ליסאטים ניתן לשנות בקלות ביוכימית ולהשתמש בתנאים שיכולים להיות מזיקים או בלתי אפשרי להשיג בתאים חיים. מעגלי ביטוי גנים אינם צריכים להתמודד או להתחרות בתהליכים ביולוגיים מארחים, ובדיקת מעגלים גנטיים חדשים היא פשוטה כמו הוספת DNA. מסיבות אלה, ביטוי גנים ללא תאים מצא יישומים שונים, מ biosensors5,6 כדי במהירות טיפוס מעגלי גנים סינתטיים7,8 לפתח תאים מלאכותיים9. רוב ביטוי הגנים ללא תאים משתמש lysates הסלולר כי כבר מעובד מאוד, בדרך כלל דורש פרוטוקולים ארוכים ומורכבים, ציוד מיוחד, ו / או צעדים רגישים שיכולים להוביל וריאציה משמעותית בין משתמשים אצוות10,11.
מאמר זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה לייצור ליסאט ללא תאים הדורש עיבוד ומומחיות מינימליים (איור 1A)12. השיטה מסתמכת על תאי E. coli כי הם מהונדסים lyse לאחר מחזור פשוט להפשיר הקפאה. התאים מבטאים אנדוליסין מפג’ למדה שמשפיל את דופן התא. ככל שהתאים גדלים, אנדוליסין זה נשאר בציטופלסמה, מופרד מקיר התא. עם זאת, מחזור פשוט להפשרת הקפאה משבש את הממברנה הציטופלסמית, משחרר את האנדוליזין לתוך הפריפלסמה, שם הוא משפיל את דופן התא, וכתוצאה מכך תמוגה מהירה של התא. הפרוטוקול יכול להסתיים עם רק כמה שעות של עבודה מעשית ודורש רק מקפיא, צנטריפוגה המסוגלת 30,000 × גרם (לקבלת תוצאות אופטימליות; מהירויות נמוכות יותר ניתן להשתמש בזהירות רבה יותר לא להפריע לכדור), מערבל מערבולת, ופתרון חיץ פשוט. ליסאט פונקציונלי יכול אפילו להיות מיוצר על ידי ייבוש קפוא של התאים rehydrating אותם במקום. עם זאת, שיטה זו מייצרת lysates עם פעילות נמוכה יותר, ככל הנראה בשל פסולת התא הנותרת.
lysates פעילים מאוד עבור ביטוי גנים ללא תאים, והם יכולים להיות משופרים בדרכים שונות בהתאם לשימוש הסופי. ניתן להגדיל עוד יותר את קצב סינתזת החלבון על ידי ריכוז ה- lysate באמצעות רכזי ספין סטנדרטיים. ניתן להגן על דנ”א ליניארי מפני השפלה על ידי הוספת חלבון GamS מטוהר. השפלת חלבונים, הכרחית לדינמיקת מעגלים מורכבת יותר כגון תנודה, ניתן להשיג על ידי הבעת הקסאמר ClpX בזן13המייצר באופן אוטומטי . לבסוף, קריאות חזותיות מבוססות LacZ מופעלות באמצעות זן autolysate חסר lacZ. בסך הכל, שיטה זו מייצרת ליסאט פעיל מאוד ללא תאים המתאים למגוון רחב של יישומים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מניב ליסאט חיידקי פעיל מאוד לביטוי גנים ללא תאים. המפתח הוא להשתמש בתאים הנושאים את pAD-LyseR, המבטא את הלמבדה פאג’ אנדוליסין בציטוזוליה. תאים אלה הם potentiated כדי lyse עצמם על permeabilization של הממברנה הפנימית, המאפשר את הגישה אנדוליסין לקיר התא, אשר השיטה משיגה באמצעות מחזור פשוט לה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לזאקרי סאן וריצ’רד מוריי (המכון הטכנולוגי של קליפורניה) על שסיפקו בחביבות את הפלסמיד P_araBAD-gamS, ואת Kaeko Kamei (המכון הטכנולוגי של קיוטו) על שסיפקו בחביבות צנטריפוגת קירור במהירות גבוהה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות ומתוכנית ARO MURI ונתמכה בחלקה על ידי היוזמה המובילה לחוקרים צעירים מצוינים, MEXT, יפן.
Materials
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
- Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
- Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
- Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free “breadboard”. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
- Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
- Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
