Schnelle, kostengünstige und unkomplizierte Herstellung von bakteriellem zellfreiem Lysat
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und einfache Methode zur Herstellung von bakteriellem Lysat für die zellfreie Genexpression unter Verwendung eines technisch hergestellten Stammes von Escherichia coli und erfordert nur Standardlaborgeräte.
Abstract
Die zellfreie Genexpression bietet die Kraft der Biologie ohne die Komplikationen eines lebenden Organismus. Obwohl es viele solcher Genexpressionssysteme gibt, sind die meisten ziemlich teuer in der Anschaffung und / oder erfordern spezielle Ausrüstung und fein geschliffenes Fachwissen, um effektiv zu produzieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Herstellung von bakteriellem zellfreiem Lysat, das ein hohes Maß an Genexpression unterstützt, nur Standardlaborgeräte verwendet und nur minimale Verarbeitung erfordert. Die Methode verwendet einen Escherichia coli-Stamm, der ein Endolysin produziert, das das Wachstum nicht beeinflusst, aber ein geerntetes Zellpellet nach einem einfachen Gefrier-Tau-Zyklus effizient lysiert. Die einzige weitere Verarbeitung, die erforderlich ist, ist eine kurze Inkubation, gefolgt von einer Zentrifugation, um das Autolysat von Zelltrümmern zu befreien. Dynamische Genschaltkreise können durch heterologe Expression der ClpX-Protease in den Zellen vor der Ernte erreicht werden. Ein E. coli-Stamm, dem das lacZ-Gen fehlt, kann für hochempfindliche, zellfreie Biosensoranwendungen unter Verwendung einer kolorimetrischen oder fluoreszierenden Anzeige verwendet werden. Das gesamte Protokoll erfordert nur 8-9 Stunden, mit nur 1-2 Stunden praktischer Arbeit von der Impfung bis zur Fertigstellung. Durch die Reduzierung der Kosten und des Zeitaufwands für die Gewinnung von zellfreiem Lysat soll diese Methode die Erschwinglichkeit der zellfreien Genexpression für verschiedene Anwendungen erhöhen.
Introduction
Die Genexpression in zellfreien Lysaten hat mehrere Vorteile gegenüber der Verwendung lebender Zellen1,2,3,4. Lysate können leicht biochemisch modifiziert und unter Bedingungen verwendet werden, die für lebende Zellen schädlich oder unmöglich zu erreichen sein könnten. Genexpressionsschaltkreise müssen nicht mit biologischen Prozessen des Wirts konkurrieren oder konkurrieren, und das Testen neuer genetischer Schaltkreise ist so einfach wie das Hinzufügen von DNA. Aus diesen Gründen hat die zellfreie Genexpression verschiedene Anwendungen gefunden, von den Biosensoren5,6 über das schnelle Prototyping synthetischer Genschaltkreise7,8 bis hin zur Entwicklung künstlicher Zellen9. Die meisten zellfreien Genexpressionen verwenden zelluläre Lysate, die hochgradig verarbeitet wurden und im Allgemeinen lange und komplexe Protokolle, spezielle Ausrüstung und / oder empfindliche Schritte erfordern, die zu erheblichen Abweichungen zwischen Benutzern und Chargen führen können10,11.
Dieses Papier beschreibt eine einfache, effiziente Methode zur Herstellung von zellfreiem Lysat, die minimale Verarbeitung und Expertise erfordert (Abbildung 1A)12. Die Methode basiert auf E. coli-Zellen, die so konstruiert sind, dass sie nach einem einfachen Gefrier-Tau-Zyklus lysieren. Die Zellen exprimieren ein Endolysin aus Phagen-Lambda, das die Zellwand abbaut. Während die Zellen wachsen, verbleibt dieses Endolysin im Zytoplasma, abgetrennt von der Zellwand. Ein einfacher Gefrier-Tau-Zyklus stört jedoch die zytoplasmatische Membran und setzt das Endolysin in das Periplasma frei, wo es die Zellwand abbaut, was zu einer schnellen Zelllyse führt. Das Protokoll kann mit nur wenigen Stunden praktischer Arbeit abgeschlossen werden und erfordert nur einen Gefrierschrank, eine Zentrifuge mit einer Kapazität von 30.000 × g (für optimale Ergebnisse; niedrigere Geschwindigkeiten können mit mehr Sorgfalt verwendet werden, um das Pellet nicht zu stören), einen Wirbelmischer und eine einfache Pufferlösung. Funktionelles Lysat kann sogar hergestellt werden, indem die Zellen gefriergetrocknet und in siturehydriert werden. Diese Methode produziert jedoch Lysate mit geringerer Aktivität, vermutlich aufgrund der verbleibenden Zelltrümmer.
Die Lysate sind hochaktiv für die zellfreie Genexpression und können je nach Endverwendung auf verschiedene Weise verbessert werden. Die Geschwindigkeit der Proteinsynthese kann weiter erhöht werden, indem das Lysat unter Verwendung von Standard-Spinkonzentratoren konzentriert wird. Lineare DNA kann durch Zugabe von gereinigtem GamS-Protein vor dem Abbau geschützt werden. Der Proteinabbau, der für komplexere Schaltkreisdynamiken wie Oszillation notwendig ist, kann durch Co-Exprimation eines ClpX-Hexamers im autolysatproduzierenden Stamm13erreicht werden. Schließlich werden LacZ-basierte visuelle Auslesungen ermöglicht, indem ein Autolysat-Stamm ohne lacZverwendet wird. Insgesamt erzeugt dieses Verfahren ein hochaktives zellfreies Lysat, das sich für ein breites Anwendungsspektrum eignet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll liefert hochaktives bakterielles Lysat für die zellfreie Genexpression. Der Schlüssel liegt darin, Zellen zu verwenden, die das Plasmid pAD-LyseR tragen, das den Lambda-Phagen Endolysin zytosolisch exprimiert. Diese Zellen werden potenziert, um sich bei der Permeabilisierung der inneren Membran selbst zu lysieren, so dass das Endolysin Zugang zur Zellwand erhält, was die Methode durch einen einfachen Gefrier-Tau-Zyklus erreicht. Da sich die Zellen effektiv selbst lysieren, wird das Prod…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Zachary Sun und Richard Murray (California Institute of Technology) für die freundliche Bereitstellung des Plasmids P_araBAD-gamS und Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) für die freundliche Bereitstellung einer Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health und des ARO MURI-Programms unterstützt und teilweise von der Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japan, unterstützt.
Materials
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
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