細菌無細胞リザートの迅速、手頃な価格、および単純な生産
Summary
このプロトコルは、 エシェリヒア大腸菌 の設計された株を使用し、標準的な実験装置のみを必要とする、無細胞遺伝子発現のための細菌リセートを生成するための迅速かつ簡単な方法を記述する。
Abstract
無細胞遺伝子発現は、生物の合併症を伴わない生物学の力を提供する。このような遺伝子発現システムの多くは存在しますが、ほとんどは購入に非常に高価であり、また/または、効果的に生産するために特別な機器と細かく磨かれた専門知識を必要とします。このプロトコルは、標準的な実験室装置のみを使用し、最小限の処理を必要とする高レベルの遺伝子発現をサポートする細菌無細胞ライセートを生成する方法を記述する。この方法は、成長に影響を与えないが、簡単な凍結融解サイクルに続いて収穫された細胞ペレットを効率的に融解する内生リンジンを産生する大腸菌株を使用する。必要な唯一のさらなる処理は、細胞の破片の自己起質をクリアするために遠心分離に続く短いインキュベーションです。動的遺伝子回路は、収穫前に細胞内のClpXプロテアーゼの異種発現によって達成することができる。lacZ遺伝子を欠いた大腸菌株は、着色または蛍光読み出しを使用して高感度、無細胞バイオセンシングアプリケーションに使用できます。プロトコル全体は8-9時間しか必要としませんが、接種から完了までの実習作業は1〜2時間です。無細胞のライセートを得るためのコストと時間を削減することによって、この方法は、様々なアプリケーションのための無細胞遺伝子発現の手頃な価格を高める必要があります。
Introduction
無細胞ライセートにおける遺伝子発現は、生細胞1、2、3、4を使用する上で、いくつかの利点がある。ライセートは生化学的に簡単に改変でき、生細胞で達成することが有害または不可能な条件で使用することができます。遺伝子発現回路は、ホスト生物学的プロセスと競合したり、競合したりする必要は一つではなく、新しい遺伝子回路のテストはDNAを追加するのと同じくらい簡単です。これらの理由から、無細胞遺伝子発現は、バイオセンサー5、6から合成遺伝子回路7、8の迅速なプロトタイピング、人工細胞9の開発まで、様々な応用を見つけた。ほとんどの無細胞遺伝子発現は、高度に処理された細胞ライセートを利用し、一般的に長く複雑なプロトコル、特殊な装置、および/または感受性の高いステップを必要とし、ユーザとバッチ10,11の間で大きな変動を引き起こす可能性がある。
この論文では、最小限の処理と専門知識を必要とする無細胞ライセートを製造するためのシンプルで効率的な方法について説明します(図1A)12。この方法は、単純な凍結融解サイクルに従ってライスするように設計された大腸菌細胞に依存する。細胞は、細胞壁を分解するファージラムダから内層分解物を発現する。細胞が成長するにつれて、この内層は細胞質に残り、細胞壁から隔離される。しかし、単純な凍結融解サイクルは細胞質膜を破壊し、子宮内膜を細胞壁を分解する周辺に放出し、細胞の分解を引き起こし、細胞の分解を迅速に生じる。このプロトコルは、わずか数時間の実践的な作業で完了することができ、冷凍庫、30,000×g(最適な結果のために;ペレットを乱さないより注意して低速を使用できる)、渦ミキサー、および簡単なバッファソリューションのみを必要とします。機能性ライセートは、細胞を凍結乾燥させてその現場で再水和することによっても生成することができる。しかし、この方法は、おそらく残りの細胞の破片のために、より低い活性を有するライセートを生成する。
ライゼートは無細胞遺伝子発現に対して非常に活性であり、最終的な使用に応じて様々な方法で増強することができる。タンパク質合成の速度は、標準的なスピン濃縮器を使用してライセートを濃縮することによってさらに増加させることができる。リニアDNAは、精製GamSタンパク質を添加することで分解から保護することができます。タンパク質分解は、振動などのより複雑な回路ダイナミクスに必要であり、自動分解物生成株13においてClpXヘキサマーを共発現させることによって達成できる。最後に、LacZ ベースのビジュアル読み出しは 、lacZを欠いている自動分解歪みを使用して有効になります。全体的に、この方法は、幅広い用途に適した高活性細胞フリーのライセートを生成する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは、無細胞遺伝子発現に対して非常に活性な細菌ライセートを生み出す。鍵は、細胞内に内反するラムダファージを発現するプラスミドpAD-LyseRを運ぶ細胞を使用することです。これらの細胞は、内膜の透過化時に自分自身を溶分解するように増強され、単純な凍結融解サイクルを通じて得られた細胞壁への内層リンアクセスを可能にする。細胞は効果的に自分自身?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ザカリー・サンとリチャード・マレー(カリフォルニア工科大学)がプラスミドP_araBADガムを提供してくれたこと、亀井佳子(京都工業大学)が高速冷却遠心分離機を親切に提供してくれたことに感謝する。この研究は、国立衛生研究所とARO MURIプログラムからの助成金によって支えられ、一部は優秀な若い研究者のためのリーディングイニシアチブ、MEXT、日本によって支援されました。
Materials
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
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