Production rapide, abordable et simple de lysat sans cellules bactériennes
Summary
Ce protocole décrit une méthode rapide et simple pour produire du lysat bactérien pour l’expression génique sans cellule, en utilisant une souche modifiée d’Escherichia coli et ne nécessitant que du matériel de laboratoire standard.
Abstract
L’expression génique sans cellules offre le pouvoir de la biologie sans les complications d’un organisme vivant. Bien qu’il existe de nombreux systèmes d’expression génique de ce type, la plupart sont assez coûteux à l’achat et / ou nécessitent un équipement spécial et une expertise finement affinée pour produire efficacement. Ce protocole décrit une méthode de production de lysat sans cellules bactériennes qui soutient des niveaux élevés d’expression génique, en utilisant uniquement de l’équipement de laboratoire standard et nécessitant un traitement minimal. La méthode utilise une souche d’Escherichia coli produisant une endolysine qui n’affecte pas la croissance, mais qui lyse efficacement une pastille cellulaire récoltée après un simple cycle de gel-dégel. Le seul traitement supplémentaire requis est une brève incubation suivie d’une centrifugation pour éliminer l’autolysat des débris cellulaires. Des circuits géniques dynamiques peuvent être obtenus grâce à l’expression hétérologue de la protéase ClpX dans les cellules avant le prélèvement. Une souche d’E. coli dépourvue du gène lacZ peut être utilisée pour des applications de biodétection haute sensibilité et sans cellules à l’aide d’une lecture colorimétrique ou fluorescente. L’ensemble du protocole nécessite aussi peu que 8-9 heures, avec seulement 1-2 heures de travail pratique de l’inoculation à l’achèvement. En réduisant le coût et le temps d’obtention du lysat sans cellule, cette méthode devrait augmenter l’abordabilité de l’expression génique sans cellule pour diverses applications.
Introduction
L’expression génique dans les lysats sans cellules présente plusieurs avantages par rapport à l’utilisation de cellules vivantes1,2,3,4. Les lysats peuvent être facilement modifiés biochimiquement et utilisés dans des conditions qui pourraient être préjudiciables ou impossibles à atteindre dans les cellules vivantes. Les circuits d’expression génique n’ont pas à rivaliser ou à rivaliser avec les processus biologiques de l’hôte, et tester de nouveaux circuits génétiques est aussi simple que d’ajouter de l’ADN. Pour ces raisons, l’expression génique sans cellules a trouvé diverses applications, des biocapteurs5,6 au prototypage rapide de circuits de gènes synthétiques7,8 au développement de cellules artificielles9. La plupart des expressions géniques sans cellules utilisent des lysats cellulaires qui ont été hautement transformés, nécessitant généralement des protocoles longs et complexes, un équipement spécialisé et / ou des étapes sensibles pouvant entraîner des variations significatives entre les utilisateurs et les lots10,11.
Cet article décrit une méthode simple et efficace de production de lysat sans cellule qui nécessite un traitement et une expertise minimes (Figure 1A)12. La méthode repose sur des cellules d’E. coli qui sont conçues pour lyser après un simple cycle de gel-dégel. Les cellules expriment une endolysine du phage lambda qui dégrade la paroi cellulaire. Au fur et à mesure que les cellules se développent, cette endolysine reste dans le cytoplasme, séquestrée de la paroi cellulaire. Cependant, un simple cycle de gel-dégel perturbe la membrane cytoplasmique, libérant l’endolysine dans le périplasme, où elle dégrade la paroi cellulaire, entraînant une lyse cellulaire rapide. Le protocole peut être complété avec seulement quelques heures de travail pratique et ne nécessite qu’un congélateur, une centrifugeuse capable de 30 000 × g (pour des résultats optimaux; des vitesses plus faibles peuvent être utilisées avec plus de soin pour ne pas déranger le granulé), un mélangeur vortex et une solution tampon simple. Le lysat fonctionnel peut même être produit en lyophilisant les cellules et en les réhydratant in situ. Cependant, cette méthode produit des lysats avec une activité plus faible, probablement en raison des débris cellulaires restants.
Les lysats sont très actifs pour l’expression de gènes sans cellules, et ils peuvent être améliorés de différentes manières en fonction de l’utilisation finale. Le taux de synthèse des protéines peut être encore augmenté en concentrant le lysat à l’aide de concentrateurs de spin standard. L’ADN linéaire peut être protégé de la dégradation en ajoutant de la protéine GamS purifiée. La dégradation des protéines, nécessaire à une dynamique de circuit plus complexe telle que l’oscillation, peut être obtenue en co-exprimant un hexamère ClpX dans la souche13productrice d’autolysats. Enfin, les lectures visuelles basées sur LacZ sont activées en utilisant une souche autolysée dépourvue de lacZ. Dans l’ensemble, cette méthode produit un lysat sans cellules hautement actif qui convient à un large éventail d’applications.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici produit un lysat bactérien hautement actif pour l’expression de gènes sans cellules. La clé est d’utiliser des cellules porteuses du plasmide pAD-LyseR, qui exprime l’endolysine du phage lambda de manière cytosolique. Ces cellules sont potentialisées pour se lyser lors de la perméabilisation de la membrane interne, permettant à l’endolysine d’accéder à la paroi cellulaire, ce que la méthode réalise grâce à un simple cycle de gel-dégel. Parce que les cellules se lysent effi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Zachary Sun et Richard Murray (California Institute of Technology) d’avoir aimablement fourni le plasmide P_araBAD-gamS, et Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) d’avoir aimablement fourni une centrifugeuse de refroidissement à grande vitesse. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health et du programme ARO MURI et a été en partie soutenu par la Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japon.
Materials
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
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