إنتاج سريع وبأسعار معقولة وغير معقد من ليسات خالية من الخلايا البكتيرية
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة وبسيطة لإنتاج اليزحات البكتيرية للتعبير الجيني الخالي من الخلايا ، وذلك باستخدام سلالة هندسية من الإشريكية القولونية وتتطلب معدات مختبرية قياسية فقط.
Abstract
التعبير الجيني الخالي من الخلايا يوفر قوة البيولوجيا دون مضاعفات الكائن الحي. على الرغم من وجود العديد من أنظمة التعبير الجيني هذه ، فإن معظمها مكلف للغاية لشراء و / أو تتطلب معدات خاصة وخبرة شحذ بدقة لإنتاج فعال. يصف هذا البروتوكول طريقة لإنتاج ليسات خالية من الخلايا البكتيرية تدعم مستويات عالية من التعبير الجيني ، وذلك باستخدام معدات المختبر القياسية فقط وتتطلب الحد الأدنى من المعالجة. تستخدم الطريقة سلالة الإشريكية القولونية التي تنتج الإندوريسين الذي لا يؤثر على النمو ، ولكنه يقوم بكفاءة بفرز بيليه الخلية المحصودة بعد دورة تجميد ذوبان بسيطة. والمعالجة الإضافية الوحيدة المطلوبة هي حضانة قصيرة يتبعها الطرد المركزي لتطهير الخلايا من الحطام الخلوي. يمكن تحقيق الدوائر الجينية الديناميكية من خلال التعبير عن heterologous من protease ClpX في الخلايا قبل الحصاد. يمكن استخدام سلالة الإشريكية القولونية التي تفتقر إلى جين lacZ لتطبيقات الاستشعار الحيوي عالية الحساسية والخالية من الخلايا باستخدام قراءات ملونة أو فلورية. يتطلب البروتوكول بأكمله ما لا يزيد عن 8-9 ساعات ، مع 1-2 ساعة فقط من العمل العملي من التطعيم إلى الانتهاء. ومن خلال خفض التكلفة والوقت للحصول على ليسات خالية من الخلايا، ينبغي أن تزيد هذه الطريقة من القدرة على تحمل تكاليف التعبير الجيني الخالي من الخلايا لمختلف التطبيقات.
Introduction
التعبير الجيني في الخلايا الخالية من الخلايا lysates له العديد من المزايا على استخدام الخلاياالحية1،2،3،4. يمكن تعديل اللسات بسهولة كيميائيا حيوية واستخدامها في ظروف يمكن أن تكون ضارة أو مستحيلة التحقيق في الخلايا الحية. لا يتعين على دوائر التعبير الجيني أن تتنافس أو تتنافس مع العمليات البيولوجية المضيفة، واختبار الدوائر الجينية الجديدة بسيط مثل إضافة الحمض النووي. لهذه الأسباب، وجدت التعبير الجيني الخالي من الخلايا تطبيقات مختلفة، من أجهزة الاستشعارالحيوية 5،6 إلى النماذج الأولية بسرعة دوائر الجينات الاصطناعية7،8 لتطوير الخلايا الاصطناعية9. معظم التعبير الجيني الخالي من الخلايا يستخدم الخلايا الlysates التي تم تجهيزها بشكل كبير، تتطلب عموما بروتوكولات طويلة ومعقدة، والمعدات المتخصصة، و / أو الخطوات الحساسة التي يمكن أن تؤدي إلى اختلاف كبير بين المستخدمين والدفعات10،11.
تصف هذه الورقة طريقة بسيطة وفعالة لإنتاج lysate خالية من الخلايا التي تتطلب الحد الأدنى من المعالجة والخبرة (الشكل 1A)12. تعتمد الطريقة على خلايا الإشريكية القولونية التي تم تصميمها للليس بعد دورة تجميد ذوبان بسيطة. الخلايا تعبر عن انداليسين من لامبدا phage التي تتحلل جدار الخلية. كما تنمو الخلايا, هذا الإندولاسين لا يزال في السيتوبلازم, عزل من جدار الخلية. ومع ذلك ، فإن دورة التجميد والذوبان البسيطة تعطل الغشاء السيتوبلازمي ، وتطلق الإندوريسين في periplasm ، حيث تتحلل جدار الخلية ، مما يؤدي إلى تحلل سريع للخلية. يمكن الانتهاء من البروتوكول مع بضع ساعات فقط من العمل العملي ويتطلب فقط ثلاجة، جهاز طرد مركزي قادر على 30،000 × غرام (للحصول على نتائج مثالية؛ يمكن استخدام سرعات أقل مع مزيد من الرعاية لعدم إزعاج بيليه)، خلاط دوامة، ومحلول عازل بسيط. يمكن حتى أن تنتج lysate وظيفية عن طريق تجميد تجفيف الخلايا وإعادة ترطيب لهم في الموقع. ومع ذلك، تنتج هذه الطريقة lysates مع نشاط أقل، ويفترض أن يرجع ذلك إلى حطام الخلية المتبقية.
الlysates نشطة للغاية للتعبير الجيني الخالي من الخلايا ، ويمكن تعزيزها بطرق مختلفة اعتمادا على الاستخدام النهائي. يمكن زيادة معدل تخليق البروتين عن طريق تركيز اليزيت باستخدام المكثفات الدورانية القياسية. يمكن حماية الحمض النووي الخطي من التدهور عن طريق إضافة بروتين GamS المنقى. يمكن تحقيق تدهور البروتين ، الضروري لديناميكيات الدوائر الأكثر تعقيدا مثل التذبذب ، من خلال التعبير المشترك عن سداسي ClpX في سلالة إنتاج التحلل التلقائي13. وأخيرا، يتم تمكين قراءات البصرية المستندة إلى LacZ باستخدام سلالة autolysate تفتقر إلى lacZ. بشكل عام، ينتج هذا الأسلوب lysate الخالية من الخلايا النشطة للغاية التي تناسب مجموعة واسعة من التطبيقات.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الموصوف هنا ينتج lysate البكتيرية نشطة للغاية للتعبير الجيني الخالي من الخلايا. المفتاح هو استخدام الخلايا التي تحمل pAD-LyseR البلازميد، الذي يعبر عن لامبدا فاج إندوليسين سيوليكالي. هذه الخلايا هي قوية لlyse أنفسهم عند permeabilization من الغشاء الداخلي، مما يسمح للاندوريسين الوصول إلى جدار …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفان زاكاري صن وريتشارد موراي (معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا) على التكرم بتوفير جهاز P_araBAD-gamS، وكيكو كامي (معهد كيوتو للتكنولوجيا) لتكرمهم بتوفير جهاز طرد مركزي عالي السرعة للتبريد. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة ومن برنامج ARO MURI، وتم دعمه جزئيا من قبل المبادرة الرائدة للباحثين الشباب الممتازين، MEXT، اليابان.
Materials
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
- Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
- Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
- Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free “breadboard”. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
- Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
- Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
