Production rapide, abordable et simple de lysat sans cellules bactériennes

Robert M. Cooper; Taishi Tonooka; Andriy Didovyk; Jeff Hasty

doi:10.3791/62753

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Article de méthode

Production rapide, abordable et simple de lysat sans cellules bactériennes

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DOI :

10.3791/62753

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29 octobre 2021

Robert M. Cooper^*¹ , Taishi Tonooka^*¹^,² , Andriy Didovyk^*¹^,³ , Jeff Hasty¹^,⁴^,⁵

¹Biocircuits Institute, University of California, San Diego, ²Present address, Kyoto Institute of Technology, ³Present address, Vertex Pharmaceuticals, ⁴Department of Bioengineering, University of California, San Diego, ⁵Molecular Biology Section, University of California, San Diego

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode rapide et simple pour produire du lysat bactérien pour l’expression génique sans cellule, en utilisant une souche modifiée d’Escherichia coli et ne nécessitant que du matériel de laboratoire standard.

Résumé

L’expression génique sans cellules offre le pouvoir de la biologie sans les complications d’un organisme vivant. Bien qu’il existe de nombreux systèmes d’expression génique de ce type, la plupart sont assez coûteux à l’achat et / ou nécessitent un équipement spécial et une expertise finement affinée pour produire efficacement. Ce protocole décrit une méthode de production de lysat sans cellules bactériennes qui soutient des niveaux élevés d’expression génique, en utilisant uniquement de l’équipement de laboratoire standard et nécessitant un traitement minimal. La méthode utilise une souche d’Escherichia coli produisant une endolysine qui n’affecte pas la croissance, mais qui lyse efficacement une pastille cellulaire récoltée après un simple cycle de gel-dégel. Le seul traitement supplémentaire requis est une brève incubation suivie d’une centrifugation pour éliminer l’autolysat des débris cellulaires. Des circuits géniques dynamiques peuvent être obtenus grâce à l’expression hétérologue de la protéase ClpX dans les cellules avant le prélèvement. Une souche d’E. coli dépourvue du gène lacZ peut être utilisée pour des applications de biodétection haute sensibilité et sans cellules à l’aide d’une lecture colorimétrique ou fluorescente. L’ensemble du protocole nécessite aussi peu que 8-9 heures, avec seulement 1-2 heures de travail pratique de l’inoculation à l’achèvement. En réduisant le coût et le temps d’obtention du lysat sans cellule, cette méthode devrait augmenter l’abordabilité de l’expression génique sans cellule pour diverses applications.

Introduction

L’expression génique dans les lysats sans cellules présente plusieurs avantages par rapport à l’utilisation de cellules vivantes¹^,²^,³^,⁴. Les lysats peuvent être facilement modifiés biochimiquement et utilisés dans des conditions qui pourraient être préjudiciables ou impossibles à atteindre dans les cellules vivantes. Les circuits d’expression génique n’ont pas à rivaliser ou à rivaliser avec les processus biologiques de l’hôte, et tester de nouveaux circuits génétiques est aussi simple que d’ajouter de l’ADN. Pour ces raisons, l’expression g....