Быстрое, доступное и несложное производство бактериального бесклеточного лизата
Summary
Этот протокол описывает быстрый и простой метод получения бактериального лизата для бесклеточной экспрессии генов, используя инженерный штамм кишечной палочки и требуя только стандартного лабораторного оборудования.
Abstract
Бесклеточная экспрессия генов предлагает силу биологии без осложнений живого организма. Хотя существует много таких систем экспрессии генов, большинство из них довольно дороги в покупке и / или требуют специального оборудования и тонко отточенного опыта для эффективного производства. Этот протокол описывает способ получения бактериального бесклеточного лизата, который поддерживает высокие уровни экспрессии генов, используя только стандартное лабораторное оборудование и требуя минимальной обработки. В методе используется штамм Escherichia coli, производящий эндолизин, который не влияет на рост, но который эффективно лизирует собранную гранулу клеток после простого цикла замораживания-оттаивания. Единственной дополнительной обработкой, требуемой, является короткая инкубация с последующим центрифугированием для очистки аутолизата от клеточного мусора. Динамические генные цепи могут быть достигнуты путем гетерологичной экспрессии протеазы ClpX в клетках перед сбором. Штамм E. coli, в котором отсутствует ген lacZ, может быть использован для высокочувствительных, бесклеточных биозондирования с использованием колориметрического или флуоресцентного считывания. Весь протокол требует всего 8-9 часов, и только 1-2 часа практического труда от прививки до завершения. Сокращая стоимость и время получения бесклеточного лизата, этот метод должен повысить доступность бесклеточной экспрессии генов для различных применений.
Introduction
Экспрессия генов в бесклеточных лизатах имеет ряд преимуществ по сравнению с использованием живых клеток1,2,3,4. Лизаты могут быть легко модифицированы биохимически и использованы в условиях, которые могут быть вредными или невозможными для достижения в живых клетках. Схемы экспрессии генов не должны конкурировать или конкурировать с биологическими процессами хозяина, и тестирование новых генетических схем так же просто, как добавление ДНК. По этим причинам бесклетовая экспрессия генов нашла различные применения, от биосенсоров5,6 до быстрого прототипирования синтетических генных схем7,8 и разработки искусственных клеток9. В большинстве бесклеточных экспрессий генов используются клеточные лизаты, которые были сильно обработаны, как правило, требуя длинных и сложных протоколов, специализированного оборудования и / или чувствительных шагов, которые могут привести к значительным различиям между пользователями и партиями10,11.
В данной работе описывается простой и эффективный способ получения бесклеточного лизата, требующий минимальной обработки и экспертизы(Рисунок 1А)12. Метод основан на клетках E. coli, которые спроектированы для лизирования после простого цикла замораживания-оттаивания. Клетки экспрессируют эндолизин из фаговой лямбды, который разрушает клеточную стенку. По мере роста клеток этот эндолизин остается в цитоплазме, изолированной от клеточной стенки. Однако простой цикл замораживания-оттаивания нарушает цитоплазматическую мембрану, высвобождая эндолизин в периплазму, где он разрушает клеточную стенку, что приводит к быстрому лизису клеток. Протокол может быть завершен всего несколькими часами практической работы и требует только морозильной камеры, центрифуги, способной на 30 000 × г (для достижения оптимальных результатов; более низкие скорости можно использовать с большей осторожностью, чтобы не беспокоить гранулу), вихревой смеситель и простой буферный раствор. Функциональный лизат может быть даже получен путем сублимационной сушки клеток и их регидратации in situ. Однако этот метод производит лизаты с более низкой активностью, предположительно из-за оставшегося клеточного мусора.
Лизаты очень активны для бесклеточной экспрессии генов, и они могут быть усилены различными способами в зависимости от конечного использования. Скорость синтеза белка может быть дополнительно увеличена путем концентрации лизата с использованием стандартных спиновых концентраторов. Линейная ДНК может быть защищена от деградации путем добавления очищенного белка GamS. Деградация белка, необходимая для более сложной динамики схемы, такой как колебания, может быть достигнута путем совместной экспрессии гексамера ClpX в аутолизат-продуцирующей деформации13. Наконец, визуальные показания на основе LacZ включаются с помощью автолизатной деформации, отсутствующей lacZ. В целом, этот метод производит высокоактивный бесклеточный лизат, который подходит для широкого спектра применений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, дает высокоактивный бактериальный лизат для бесклеточной экспрессии генов. Ключ заключается в использовании клеток, несущих плазмиду pAD-LyseR, которая экспрессирует цитозольный цитозинов лямбда-фаг эндолизин. Эти клетки потенцируются для лизирования при перм?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Закари Сан и Ричарда Мюррея (Калифорнийский технологический институт) за любезное предоставление плазмидного P_araBAD-gamS, а также Каэко Камэй (Технологический институт Киото) за любезное предоставление высокоскоростной охлаждающей центрифуги. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения и программы ARO MURI и частично поддержана Ведущей инициативой для отличных молодых исследователей, MEXT, Япония.
Materials
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
- Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
- Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
- Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free “breadboard”. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
- Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
- Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
