Producción rápida, asequible y sin complicaciones de lisado bacteriano libre de células
Summary
Este protocolo describe un método rápido y simple para producir lisado bacteriano para la expresión génica libre de células, utilizando una cepa modificada de Escherichia coli y requiriendo solo equipo de laboratorio estándar.
Abstract
La expresión génica libre de células ofrece el poder de la biología sin las complicaciones de un organismo vivo. Aunque existen muchos de estos sistemas de expresión génica, la mayoría son bastante caros de comprar y / o requieren equipos especiales y experiencia finamente perfeccionada para producir de manera efectiva. Este protocolo describe un método para producir lisado libre de células bacterianas que admite altos niveles de expresión génica, utilizando solo equipos de laboratorio estándar y requiriendo un procesamiento mínimo. El método utiliza una cepa de Escherichia coli que produce una endolisina que no afecta el crecimiento, pero que lisa eficientemente un pellet celular cosechado después de un simple ciclo de congelación-descongelación. El único procesamiento adicional requerido es una breve incubación seguida de centrifugación para limpiar el autolisado de desechos celulares. Los circuitos genéticos dinámicos se pueden lograr a través de la expresión heteróloga de la proteasa ClpX en las células antes de la recolección. Una cepa de E. coli que carece del gen lacZ se puede utilizar para aplicaciones de biodetección de alta sensibilidad y libre de células utilizando una lectura colorimétrica o fluorescente. Todo el protocolo requiere tan solo 8-9 horas, con solo 1-2 horas de trabajo práctico desde la inoculación hasta la finalización. Al reducir el costo y el tiempo para obtener lisado libre de células, este método debería aumentar la asequibilidad de la expresión génica libre de células para diversas aplicaciones.
Introduction
La expresión génica en lisados libres de células tiene varias ventajas sobre el uso de células vivas1,2,3,4. Los lisados pueden modificarse bioquímicamente fácilmente y usarse en condiciones que podrían ser perjudiciales o imposibles de lograr en células vivas. Los circuitos de expresión génica no tienen que competir con los procesos biológicos del huésped, y probar nuevos circuitos genéticos es tan simple como agregar ADN. Por estas razones, la expresión génica libre de células ha encontrado diversas aplicaciones, desde biosensores5,6 hasta la rápida creación de prototipos de circuitos genéticos sintéticos7,8 y el desarrollo de células artificiales9. La mayoría de la expresión génica libre de células utiliza lisados celulares que han sido altamente procesados, generalmente requieren protocolos largos y complejos, equipos especializados y / o pasos sensibles que pueden conducir a una variación significativa entre los usuarios y los lotes10,11.
Este documento describe un método simple y eficiente para producir lisado libre de células que requiere un procesamiento y experiencia mínimos(Figura 1A)12. El método se basa en células de E. coli que están diseñadas para lisarse después de un simple ciclo de congelación-descongelación. Las células expresan una endolisina del fago lambda que degrada la pared celular. A medida que las células crecen, esta endolisina permanece en el citoplasma, secuestrada de la pared celular. Sin embargo, un simple ciclo de congelación-descongelación interrumpe la membrana citoplasmática, liberando la endolisina en el periplasma, donde degrada la pared celular, lo que resulta en una rápida lisis celular. El protocolo se puede completar con solo unas pocas horas de trabajo práctico y solo requiere un congelador, una centrífuga capaz de 30,000 × g (para obtener resultados óptimos; se pueden usar velocidades más bajas con más cuidado para no molestar el pellet), un mezclador de vórtice y una solución tampón simple. El lisado funcional puede incluso producirse mediante la liofilización de las células y su rehidratación in situ. Sin embargo, este método produce lisados con menor actividad, presumiblemente debido a los restos celulares restantes.
Los lisados son altamente activos para la expresión génica libre de células, y se pueden mejorar de varias maneras dependiendo del uso final. La tasa de síntesis de proteínas se puede aumentar aún más concentrando el lisado utilizando concentradores de espín estándar. El ADN lineal se puede proteger de la degradación mediante la adición de proteína GamS purificada. La degradación de proteínas, necesaria para una dinámica de circuitos más compleja como la oscilación, se puede lograr coexpresando un hexámero ClpX en la cepa productora de autolisato13. Finalmente, las lecturas visuales basadas en LacZ se habilitan mediante el uso de una tensión de autolisado que carece de lacZ. En general, este método produce lisado libre de células altamente activo que es adecuado para una amplia gama de aplicaciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí produce lisado bacteriano altamente activo para la expresión génica libre de células. La clave es utilizar células portadoras del plásmido pAD-LyseR, que expresa el fago lambda endolisina citosólicamente. Estas células se potencian para lisarse a sí mismas tras la permeabilización de la membrana interna, permitiendo el acceso de la endolisina a la pared celular, lo que el método logra a través de un simple ciclo de congelación-descongelación. Debido a que las células se lisan efe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Zachary Sun y Richard Murray (Instituto de Tecnología de California) por proporcionar amablemente el plásmido P_araBAD-gamS, y a Kaeko Kamei (Instituto de Tecnología de Kyoto) por proporcionar amablemente una centrífuga de enfriamiento de alta velocidad. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud y del programa ARO MURI y fue apoyado en parte por la Iniciativa Líder para Jóvenes Investigadores Excelentes, MEXT, Japón.
Materials
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
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