Snabb, prisvärd och okomplicerad produktion av bakteriell cellfri lysate
Summary
Detta protokoll beskriver en snabb och enkel metod för att producera bakteriell lysate för cellfria genuttryck, med hjälp av en konstruerad stam av Escherichia coli och kräver endast standard laboratorieutrustning.
Abstract
Cellfritt genuttryck erbjuder biologins kraft utan komplikationer av en levande organism. Även om många sådana genuttryckssystem finns, är de flesta ganska dyra att köpa och / eller kräver speciell utrustning och finslipad expertis för att producera effektivt. Detta protokoll beskriver en metod för att producera bakteriell cellfri lysate som stöder höga nivåer av genuttryck, använder endast standard laboratorieutrustning och kräver minimal bearbetning. Metoden använder en Escherichia coli-stam som producerar en endolysin som inte påverkar tillväxten, men som effektivt lyser en skördad cellpellet efter en enkel frys-tina cykel. Den enda ytterligare bearbetningen som krävs är en kort inkubation följt av centrifugering för att rensa autolysatet av cellulära skräp. Dynamiska genkretsar kan uppnås genom heterologt uttryck av ClpX-proteasen i cellerna före skörd. En E. coli-stam som saknar lacZ-genen kan användas för högkänsliga, cellfria bioseneringsapplikationer med hjälp av en koloretrik eller fluorescerande avläsning. Hela protokollet kräver så få som 8-9 timmar, med endast 1-2 timmars praktiskt arbete från inokulering till slutförande. Genom att minska kostnaden och tiden för att få cellfri lysat bör denna metod öka överkomliga priser på cellfria genuttryck för olika tillämpningar.
Introduction
Genuttryck i cellfria lysater har flera fördelar jämfört med att använda levande celler1,2,3,4. Lysater kan enkelt modifieras biokemiskt och användas under förhållanden som kan vara skadliga för eller omöjliga att uppnå i levande celler. Genuttryckskretsar behöver inte kämpa eller konkurrera med värdbiologiska processer, och att testa nya genetiska kretsar är lika enkelt som att lägga till DNA. Av dessa skäl har cellfritt genuttryck hittat olika tillämpningar, från biosensorer5,6 till snabbt prototyping syntetiska genkretsar7,8 till att utveckla konstgjorda celler9. De flesta cellfria genuttryck använder cellulära lysater som har bearbetats mycket, vilket i allmänhet kräver långa och komplexa protokoll, specialiserad utrustning och / eller känsliga steg som kan leda till betydande variation mellan användare och partier10,11.
Detta dokument beskriver en enkel och effektiv metod för att producera cellfri lysat som kräver minimal bearbetning och expertis (figur 1A)12. Metoden bygger på E. coli-celler som är konstruerade för att lysa efter en enkel frys-tina cykel. Cellerna uttrycker en endolysin från faglamda som försämrar cellväggen. När cellerna växer förblir denna endolysin i cytoplasman, separerad från cellväggen. En enkel frys-tina cykel stör dock cytoplasmamembranet, släpper endolysin i periplasman, där det försämrar cellväggen, vilket resulterar i snabb celllys. Protokollet kan slutföras med endast några timmars praktiskt arbete och kräver endast en frys, en centrifug som kan 30 000 × g (för optimalt resultat; lägre hastigheter kan användas med större omsorg för att inte störa pelleten), en virvelblandare och en enkel buffertlösning. Funktionell lysat kan till och med produceras genom att frysa cellerna och rehydrera dem på plats. Denna metod producerar dock lysater med lägre aktivitet, förmodligen på grund av de återstående cellresterna.
Lysaterna är mycket aktiva för cellfria genuttryck, och de kan förbättras på olika sätt beroende på slutanvändningen. Proteinsyntesen kan ökas ytterligare genom att lysate koncentreras med hjälp av vanliga spinnkoncentratorer. Linjärt DNA kan skyddas från nedbrytning genom att tillsätta renat GamS-protein. Proteinnedbrytning, som är nödvändig för mer komplex kretsdynamik som svängning, kan uppnås genom att uttrycka en ClpX-hexamer i den autolysatproducerande stammen13. Slutligen aktiveras LacZ-baserade visuella avläsningar genom att använda en automatiskt använd stam som saknar lacZ. Sammantaget producerar denna metod mycket aktiv cellfri lysate som är lämplig för ett brett spektrum av applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs här ger mycket aktiv bakteriell lysate för cell-free genuttryck. Nyckeln är att använda celler som bär plasmid pAD-LyseR, som uttrycker lambda phage endolysin cytosolically. Dessa celler förstärks för att lysa sig vid permeabilisering av det inre membranet, vilket ger endolysin tillgång till cellväggen, vilket metoden uppnår genom en enkel frys-tina cykel. Eftersom cellerna effektivt lyses sig, kallas produkten autolysate. Efter att cellerna har lyst är de enda återstående stegen in…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Zachary Sun och Richard Murray (California Institute of Technology) för att de vänligt tillhandahåller plasmiden P_araBAD-gamS, och Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) för att vänligt ha tillhandahållit en höghastighetskylningscentrug. Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health och från ARO MURI-programmet och stöddes delvis av Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japan.
Materials
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
- Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
- Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
- Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free “breadboard”. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
- Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
- Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
