Snelle, betaalbare en ongecompliceerde productie van bacteriële celvrije lysaat
Summary
Dit protocol beschrijft een snelle en eenvoudige methode om bacterieel lysaat te produceren voor celvrije genexpressie, met behulp van een gemanipuleerde stam van Escherichia coli en waarvoor alleen standaard laboratoriumapparatuur nodig is.
Abstract
Celvrije genexpressie biedt de kracht van biologie zonder de complicaties van een levend organisme. Hoewel er veel van dergelijke genexpressiesystemen bestaan, zijn de meeste vrij duur om te kopen en / of vereisen ze speciale apparatuur en fijnmazige expertise om effectief te produceren. Dit protocol beschrijft een methode om bacterieel celvrij lysaat te produceren dat hoge niveaus van genexpressie ondersteunt, waarbij alleen standaard laboratoriumapparatuur wordt gebruikt en minimale verwerking vereist is. De methode maakt gebruik van een Escherichia coli-stam die een endolysine produceert die de groei niet beïnvloedt, maar die een geoogste celkorrel efficiëntlyseert na een eenvoudige vries-dooicyclus. De enige verdere verwerking die nodig is, is een korte incubatie gevolgd door centrifugering om het autolysaat van cellulair puin te verwijderen. Dynamische gencircuits kunnen worden bereikt door heterologe expressie van het ClpX-protease in de cellen vóór het oogsten. Een E. coli-stam zonder het lacZ-gen kan worden gebruikt voor hooggevoelige, celvrije biosensingtoepassingen met behulp van een colorimetrische of fluorescerende uitlezing. Het hele protocol vereist slechts 8-9 uur, met slechts 1-2 uur hands-on arbeid van inenting tot voltooiing. Door de kosten en tijd te verminderen om celvrij lysaat te verkrijgen, moet deze methode de betaalbaarheid van celvrije genexpressie voor verschillende toepassingen vergroten.
Introduction
Genexpressie in celvrije lysaten heeft verschillende voordelen ten opzichte van het gebruik van levende cellen1,2,3,4. Lysaten kunnen gemakkelijk biochemisch worden gemodificeerd en worden gebruikt in omstandigheden die schadelijk of onmogelijk te bereiken zijn in levende cellen. Genexpressiecircuits hoeven niet te concurreren met biologische processen van de gastheer en het testen van nieuwe genetische circuits is net zo eenvoudig als het toevoegen van DNA. Om deze redenen heeft celvrije genexpressie verschillende toepassingen gevonden, van biosensoren5,6 tot het snel prototypen van synthetische gencircuits7,8 tot het ontwikkelen van kunstmatige cellen9. De meeste celvrije genexpressie maakt gebruik van cellulaire lysaten die sterk zijn verwerkt, wat over het algemeen lange en complexe protocollen, gespecialiseerde apparatuur en / of gevoelige stappen vereist die kunnen leiden tot aanzienlijke variatie tussen gebruikers en batches10,11.
Dit artikel beschrijft een eenvoudige, efficiënte methode voor het produceren van celvrij lysaat dat minimale verwerking en expertise vereist(Figuur 1A)12. De methode is gebaseerd op E. coli-cellen die zijn ontworpen om te lyseren na een eenvoudige vries-dooicyclus. De cellen drukken een endolysine uit faag lambda die de celwand afbreekt. Terwijl de cellen groeien, blijft dit endolysine achter in het cytoplasma, gesekwestreerd uit de celwand. Een eenvoudige vries-dooicyclus verstoort echter het cytoplasmatische membraan, waardoor de endolysine vrijkomt in het periplasma, waar het de celwand afbreekt, wat resulteert in snelle cellysis. Het protocol kan worden voltooid met slechts een paar uur hands-on werk en vereist alleen een vriezer, een centrifuge van 30.000 × g (voor optimale resultaten; lagere snelheden kunnen met meer zorg worden gebruikt om de pellet niet te verstoren), een vortexmixer en een eenvoudige bufferoplossing. Functioneel lysaat kan zelfs worden geproduceerd door de cellen te vriesdrogen en ter plaatse opnieuw te hydrateren. Deze methode produceert echter lysaten met een lagere activiteit, vermoedelijk als gevolg van het resterende celafval.
De lysaten zijn zeer actief voor celvrije genexpressie en ze kunnen op verschillende manieren worden verbeterd, afhankelijk van het eindgebruik. De snelheid van eiwitsynthese kan verder worden verhoogd door het lysaat te concentreren met behulp van standaard spinconcentrators. Lineair DNA kan worden beschermd tegen afbraak door het toevoegen van gezuiverd GamS-eiwit. Eiwitdegradatie, noodzakelijk voor complexere circuitdynamica zoals oscillatie, kan worden bereikt door een ClpX-hexameer in de autolysaatproducerende stamco-expressie te geven 13. Ten slotte worden op LacZ gebaseerde visuele uitlezingen mogelijk gemaakt door gebruik te maken van een autolysaatbelasting zonder lacZ. Over het algemeen produceert deze methode zeer actief celvrij lysaat dat geschikt is voor een breed scala aan toepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol levert zeer actief bacterieel lysaat op voor celvrije genexpressie. De sleutel is om cellen te gebruiken die het plasmide pAD-LyseR dragen, dat de lambdafaag endolysine cytosolisch tot expressie brengt. Deze cellen worden gepotentieerd om zichzelf te lyseren bij permeabilisatie van het binnenmembraan, waardoor de endolysine toegang krijgt tot de celwand, wat de methode bereikt door een eenvoudige vries-dooicyclus. Omdat de cellen zichzelf effectief lyseren, wordt het product autolysaat genoem…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Zachary Sun en Richard Murray (California Institute of Technology) voor het leveren van het plasmide P_araBAD-gamS, en Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) voor het vriendelijk leveren van een snelle koelcentrifuge. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health en van het ARO MURI-programma en werd gedeeltelijk ondersteund door het Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japan.
Materials
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
- Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
- Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
- Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free “breadboard”. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
- Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
- Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
