Hurtig, overkommelig og ukompliceret produktion af bakteriecellefri lysat
Summary
Denne protokol beskriver en hurtig og enkel metode til fremstilling af bakteriel lysat til cellefri genekspression ved hjælp af en konstrueret stamme af Escherichia coli og kræver kun standard laboratorieudstyr.
Abstract
Cellefri genekspression giver kraften i biologi uden komplikationer af en levende organisme. Selv om mange sådanne genekspressionssystemer findes, de fleste er ret dyre at købe og / eller kræver særligt udstyr og fint finpudset ekspertise til at producere effektivt. Denne protokol beskriver en metode til fremstilling af bakteriecellefri lysat, der understøtter høje niveauer af genekspression, kun ved hjælp af standard laboratorieudstyr og kræver minimal behandling. Metoden bruger en Escherichia coli stamme producerer en endolysin, der ikke påvirker væksten, men som effektivt lyses en høstet celle pellet efter en simpel fryse-optø cyklus. Den eneste yderligere behandling, der kræves, er en kort inkubation efterfulgt af centrifugering for at rydde autolysatet af cellulære snavs. Dynamiske genkredsløb kan opnås gennem heterologt udtryk for ClpX protease i cellerne før høst. En E. coli stamme mangler lacZ genet kan bruges til høj følsomhed, cellefri biosensing applikationer ved hjælp af en colorimetric eller fluorescerende udlæsning. Hele protokollen kræver så få som 8-9 timer, med kun 1-2 timers praktisk arbejde fra podning til færdiggørelse. Ved at reducere omkostningerne og tiden til at opnå cellefri lysat, bør denne metode øge overkommeligheden af celle-fri genekspression for forskellige applikationer.
Introduction
Genekspression i cellefrie lysater har flere fordele ved at bruge levende celler1,2,3,4. Lysater kan let ændres biokemisk og anvendes under forhold, der kan være skadelige for eller umulige at opnå i levende celler. Genekspression kredsløb behøver ikke at kæmpe eller konkurrere med vært biologiske processer, og afprøvning af nye genetiske kredsløb er så simpelt som at tilføje DNA. Af disse grunde har cellefri genekspression fundet forskellige anvendelser, fra biosensorer5,6 til hurtigt prototyper syntetiske genkredsløb7,8 til udvikling af kunstige celler9. De fleste cellefri genekspression anvender cellulære lysater, der er blevet stærkt behandlet, hvilket generelt kræver lange og komplekse protokoller, specialiseret udstyr og /eller følsomme trin, der kan føre til betydelig variation mellem brugere og batches10,11.
Dette papir beskriver en enkel og effektiv metode til fremstilling af cellefri lysat, der kræver minimal behandling og ekspertise (Figur 1A)12. Metoden er afhængig af E. coli celler, der er konstrueret til at lyse efter en simpel fryse-optø cyklus. Cellerne udtrykker en endolysin fra phage lambda, der nedbryder cellevæggen. Efterhånden som cellerne vokser, forbliver denne endolysin i cytoplasmaet, der er afsondret fra cellevæggen. Men en simpel fryse-optø cyklus forstyrrer cytoplasmisk membran, frigive endolysin i periferien, hvor det nedbryder cellevæggen, hvilket resulterer i hurtig celle lysis. Protokollen kan afsluttes med kun et par timers praktisk arbejde og kræver kun en fryser, en centrifuge, der er i stand til 30.000 × g (for optimale resultater; lavere hastigheder kan bruges med mere omhu for ikke at forstyrre pellet), en vortex mixer og en simpel bufferløsning. Funktionelt lysat kan endda produceres ved frysetørring af cellerne og rehydrere dem in situ. Denne metode producerer dog lysater med lavere aktivitet, formodentlig på grund af de resterende cellerester.
Lysaterne er meget aktive for cellefri genekspression, og de kan forbedres på forskellige måder afhængigt af slutanvendelsen. Hastigheden af proteinsyntese kan øges yderligere ved at koncentrere lysatet ved hjælp af standard spin koncentratorer. Lineært DNA kan beskyttes mod nedbrydning ved at tilsætte renset GamS-protein. Proteinforringelse, der er nødvendig for mere komplekse kredsløbsdynamikker såsom svingning, kan opnås ved at co-udtrykke en ClpX hexamer i den autolysatproducerende stamme13. Endelig aktiveres LacZ-baserede visuelle udlæsninger ved hjælp af en autolysatstamme, der mangler lacZ. Samlet set producerer denne metode meget aktiv cellefri lysat, der er egnet til en bred vifte af applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den protokol, der er beskrevet her, giver meget aktivt bakterielt lysat til cellefri genekspression. Nøglen er at bruge celler, der bærer plasmid pAD-LyseR, som udtrykker lambda phage endolysin kytosolically. Disse celler er potentiated at lyse sig selv på permeabilization af den indre membran, så endolysin adgang til cellevæggen, som metoden opnår gennem en simpel fryse-optø cyklus. Fordi cellerne effektivt lyse sig selv, produktet kaldes autolysate. Efter at cellerne har tændt, er de eneste tilbageværende trin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Zachary Sun og Richard Murray (California Institute of Technology) for venligt at give plasmid P_araBAD-gamS, og Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) for venligt at give en højhastighedskøling centrifuge. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health og fra ARO MURI-programmet og blev delvist støttet af det førende initiativ for fremragende unge forskere, MEXT, Japan.
Materials
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
- Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
- Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
- Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free “breadboard”. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
- Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
- Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
