Summary
우리는 침수 된 문화와 고체 미디어 모두에서 필라멘트 곰팡이 A. nidulans의 성장 운동학을 캡처, 분석 및 정량화하기 위해 전송 된 빛 현미경 기술을 사용하여 라벨이없는 라이브 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 형광 현미경 검사법과 함께 사용할 수 있습니다.
Abstract
주로 최면/균주 적 성장률의 변화에 의존하는 필라멘트 균류의 식민지 성장이 식민지 크기를 비교하여 고화된 미디어에 거시적으로 추정된다는 것이 잘 확립되어 있습니다. 그러나, 다른 환경/성장 조건(pH, 온도, 탄소 및 질소 원, 항생제 등)하에서 유전적으로 다른 곰팡이 균주 또는 균주의 성장 속도를 정량적으로 측정하는 것은 도전적이다. 따라서, 성장 운동학을 정량화하기 위한 보완적인 접근법의 추구는 곰팡이 세포 성장을 더 잘 이해하기 위해 필수적이다. 또한, 아스퍼질러스 스프를 포함한 필라멘트 균류는 고체 미디어 또는 침수 된 문화에 대한 공중 조건하에서 뚜렷한 성장과 차별화 모드를 가지고 있는 것으로 잘 알려져 있습니다. 여기서는 침수된 배양과 고체 매체 모두에서 라이브 이미징을 사용하여 모델 균주 아스퍼질러스 니둘란스의성장 운동학을 분석하기 위한 정량적 현미경 방법을 자세히 설명합니다. 우리는 사용자의 사전 이미지 분석 전문 지식을 필요로하지 않는 방식으로, 오픈 소스, 바이오 이미지 (예를 들어, 피지)에 대한 무료 소프트웨어를 사용하여 재현 가능하고 신뢰할 수있는 방식으로 다른 곰팡이 균주의 성장 속도를 캡처합니다.
Introduction
필라멘트 균류는 큰 사회 경제적 및 생태학적 중요성, 효소 및 항생제 생산을위한 산업 / 농업 도구로 모두 중요하다1,2 및 작물 식물3의병원균으로, 해충 곤충4 및 인간3. 더욱이, 아스퍼질러스 니둘란스와 같은 필라멘트 균류는 유전학, 세포 및 진화 생물학연구뿐만 아니라 최면 연장5의연구와 같은 근본적인 연구를 위한 모델 유기체로서 널리 사용된다. 필라멘트 균류는 연장 팁6에서막 지질 /단백질의 지속적인 공급과 세포벽의 드 노보 합성을 통해 길게 하는 매우 편광 된 유기체이다. 최면 팁 성장 및 극성 유지 보수의 중심적인 역할은 주로 사이토스켈레탈 성분과 골기6,7,8의편광 분포로 구성된 고도로 정렬된 구조인 'Spitzenkorper'(SPK)라는 특수 구조이다.
환경 자극/신호, 이러한 물 공기 인터페이스, 빛,CO2 농도 및 영양 상태는 이러한 금형9에의해 이루어진 발달 결정에 대한 책임이 있다. 침수(액체) 배양에서 A. nidulans의 분화는 억압되고 성장은 최면 팁 신장6에의해 발생한다. 식물 성장 중, 무성 포자 (코니디아) 정수 확장에 의해 발아, 상호 연결된 최면 세포의 미분화 네트워크를 형성, 균사체, 영양분과 공간을 사용할 수있는 한 무기한 성장을 계속 할 수있다. 한편, 고체 미디어 최면 팁에 잔인하고 식물성장의 정의된 기간(발달 능력) 후, 무성생식이 개시되고, 공중 호디오포레 줄기는 균사체6의전문 발 세포로부터 확장된다. 이들은 유리한 환경 조건하에서 성장을 다시 시작할 수 있는 haploid conidia10의 긴 사슬을 생성하는 conidiophores에게 불린 특화된 발달 다세포 구조물을 초래합니다.
필라멘트 곰팡이 성장을 측정하는 데 널리 사용되는 방법은 페트리 접시에 함유 된 영양소 천에 포자를 접종하고 매크로로 며칠 후 식민지의 직경을 측정하는 것입니다11. 식민지의 직경/면적은 근생 성장속도의 변화에 가장 의존하고,12밀도에덜 의존하는 것으로, 성장의 가치로 사용된다. 고체 표면에서 성장하는 곰팡이 인구 (식민지) 크기를 측정하는 것은 매우 적절하지만 결코 가장 정확한 성장 척도는 아닙니다. 인구 수준 평균(곰팡이 식민지 크기의 평균)에 비해, 단일 세포 측정은 세포 집단의 이질성을 포착하고 세포의 새로운 하위 집단의 식별을 허용할 수 있으며,13,역학, 경로뿐만 아니라 세포가 내인성 및 환경 변화에 반응하는 생물학적메커니즘을 14,15. 시간 경과 현미경 검사법에 의한 곰팡이 세포 성장 및 표현형을 모니터링하는 것은 틀림없이 가장 널리 사용되는 정량적 단일 세포 관찰 접근법입니다.
본 명세서에서는, 전염된 광 현미경 기술(예: 위상 대조, 차동 간섭 대조(DIC), 편광 현미경 검사법을 사용하여 라벨없는 라이브 이미징 프로토콜을 상세히 설명하여 이미지를 캡처하는데, 이는 형광 현미경 현미경의 결합된 사용과 는 독립적으로 A. nidulans 균주의 극성 성장을 분석하고 정량화하기 위해 사용될 수 있다.
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Protocol
1. 접종 준비
참고: 모든 단계는 라미나르 흐름 캐비닛 아래에서 수행해야 합니다.
- 멸균 접종 루프를 이용한 글리세롤 육수(-80°C)로부터, 최소 미디어(MM)의 플레이트에 스트레인 검사와 관련된 적절한 영양 요건으로 보충된 글리세롤 스톡(-80°C)으로부터 관심있는 곰팡이 균주를 줄무늬 [MM: 10.0g/L 포도당, 20mL/L 염용액:26g/L KCl, 26g/L KCl, 26g/L/Mg/Mg.L 76 g/L KH2PO4,2.0 mL/L 클로로폼) 및 1 mL/L 미량 원소(미량 원소: 40 mg/L Na2B4O7· H2O, 400 mg/L CuSO4,8 g/L ZnSO4,800 mg/L MnSO4,800 mg/L FePO4),pH를 1M NaOH로 6.8로 조정하고, 1%(w/v) 한도및16및 오토클라브에 설명된 바와 같이 필요한보충제를1%로 추가하였다.
참고: 소금 용액, 미량 원소 솔루션 및 보충제는 자동화됩니다. - 37 °C에서 2 -3 일 동안 배양하십시오.
- 멸균 이쑤시개(또는 접종 루프)를 사용하여 소량의 코니디아를 단일 식민지에 부드럽게 만지고 완전한 미디어(CM) [CM: 10.0g/L 포도당, 2.0 g/L 펩톤, 1.0 g/L 효모 추출물, 1.0 g/L 카산산, 20mL/L 솔트 솔루션, 비타민 1m/ L/ mL 용액 1mL/L 용액, 비타민 1m/L 용액 0.1 g/L 리보플라빈, 0.1 g/L 니코티나미드, 0.01 g/L p-아미노 벤조산, 0.05 g/L 피리독신 HCl, 1.0 mg/L 비오틴), pH를 1M NaOH로 6.8로 조정하고, 1%(w/v) agar 및160억 을 추가합니다. 4°C의 어두운 병에 비타민 용액을 저장하여 오토클레이브를 저장합니다.
참고: 곰팡이 성장이 너무 조밀하여 개별 식민지를 식별하고 격리할 수 없는 경우, 단일 식민지를 얻기 위해 새 한천 판으로 다시 행진합니다. - 37 °C에서 3-4 일 동안 배양하십시오.
- CM 천판에서 자란 콘리디아드 곰팡이 콜로니의 표면으로부터 약 2 x 106 셀/mL의 정중 현탁액을 획득하여 멸균 이쑤시개(도S1)를사용한다.
참고: 필요한 경우 혈류계로 코니디아를 계산합니다. - 멸균 1.5 mL 원심분리기 튜브에 A. nidulans의 수확 conidias 0.05% (v/v) Tween 80 코니아 덩어리의 수를 감소시키기 위한 자동 증류수의 1.0 mLL.
참고: 코니디아는 생존 가능성의 관련 손실없이 4 °C에서 최대 2-3 주 동안 저장할 수 있습니다 (A. 아타나소풀로스와 V. 소피아노풀루, 게시되지 않은 데이터). 그러나, 간원부부종을 방지하기 위해, 균류 부품및 영양분을 제거하기 위해 편정 현탁액을 필터링 및/또는 세척하는 것이 좋습니다.
2. 한천 (고체) 매체에서 성장하는 화상 진찰 필라멘트 곰팡이 준비
참고: '반전 된 한천 방법17,18의 수정 된 버전이 사용됩니다.
- 처음에는 페트리 접시(Ø9cm) 15mL에 1%(w/v) 한천(그림 2)을 여러 지점에서 격렬하게 소용돌이로 장식한 원원(약 2 x 104 셀/mL)의 10μL 알리쿼트(그림2)를발견한다.
참고: '반전 된 천 방법'의 수정 된 버전을 사용하여, 성장 최면에 명백한 해로운 효과없이 많은 시간 동안 곰팡이 샘플을 이미지 할 수있다. - 조사될 개발 단계에 따라 실험 문화를 배양한다.
- 멸균 메스를 사용하여 식민지를 함유한 ≈0.8mm2 블록의 한고를 슬라이스합니다.
참고: 슬라이스할 한천 블록의 치수는 나중에 배치할 장비의 치수에 따라 달라집니다. 현재 작업에서는 8개의 잘 μ 슬라이드가 사용됩니다(아래 참조). - 반전하고 라이브 이미징에 적합한 커버 슬립과 μ 슬라이드 또는 유사한 8 챔버 커버 글래스의 우물에 한천 블록을 배치합니다.
참고: 송신된 광 현미경 검사법은 형광(labeling) 현미경 검사법과 병용될 경우, 한천 블록은 이미징 직전에 살아있는 세포 염색염을 함유하는 액체 배지의 액적에 반전될 수 있다.
3. 액체 매체에서 자라는 필라멘트 곰팡이 에 대한 준비
- 적절한 보충제를 함유한 8웰 μ 슬라이드(액체) MM의 우물에서10μL 알리쿼트(위 참조)를 이송한다.
- 원하는 온도에서 원하는 시간에 대해 배양한다(도3).
참고: 전염된 광 현미경 검사가 형광(labeling) 현미경 검사법과 병용하여 사용될 경우, 액체 배양은 실험19동안 원하는 시점에서 형광염료를 첨가할 수 있다는 큰 장점이 있다.
4. 이미지 캡처
참고: 현미경의 선택은 사용 가능한 장비에 따라 달라집니다. 어떤 경우에 현미경 설치는 반전 단계, 환경 챔버 또는 정밀한 공기 온도 제어가 있는 적어도 방을 포함해야 합니다.
- 37°C에서 열성 현미경 챔버를 예열하여 (달리 표시되거나 사용된 곰팡이 종에 적합하지 않는 한) 시작하기 전에 온도를 안정화시한다. 이 챔버는 시간 경과 실험 중 현미경 광학 및 샘플 단계의 온도 변조를 허용합니다. 일반 침수 오일(23°C에서 사용하도록 설계된) 오일이 37°C 이상에서 사용될 때 광학수차(20)가 도입된다는 점에 유의하십시오.
참고 : 꽉 예산에, 인큐베이션 챔버는 골판지 및 절연 포장 재료(21)로 만들 수 있습니다 또는 3D 프린터(22)를사용하여. - 현미경, 스캐너 전원, 레이저 전원 및 컴퓨터를 켜고 이미징 소프트웨어를 로드합니다. 현미경 단계와 초점에 μ 슬라이드 (이전에 준비)를 배치합니다.
- 이미지 분석 중에 성장 측정을 용이하게 하기 위해 격리되거나 겹치지 않는 셀(또는 적어도 혼잡하지 않은)을 포함하는 뷰 필드를 찾습니다. 강력한 통계 분석을 허용하기 위해 샘플당 적어도 50개의 성장하는 세포를 캡처합니다.
- 원하는 전송된 광 현미경 현미경 접근법을 선택합니다. 다른 곳에서 설명한 바와 같이, 노출 시간 또는 레이저 전력 및 픽셀 거주 시간 및/또는 핀홀 직경을 증가시켜 곰팡이 세포의 광표백을 최소화한다.
- 현미경을 설정하여 원하는 시간 간격으로 이미지를 획득하고 타임시리즈 수집을 시작합니다.
참고: 열 드리프트, 다양한 셀 크기 및 셀 모션으로 인해 시간이 지남에 따라 초점 드리프트를 수정하려면 현미경 소프트웨어에서 사용할 수 있는 경우 자동 초점 전략을 사용합니다.
5. 이미지 분석
참고: 이 섹션에서는 A. nidulans의성장률을 측정하기 위한 시간 경과 현미경 이미지를 처리하는 주요 단계를 설명합니다. 이미지의 개방, 시각화 및 처리는 오픈 소스 ImageJ /피지 소프트웨어(25)로수행됩니다.
- 플러그인 | 사용하여 피지에 이미지를 가져 오기 바이오 포맷 | 기본 설정피지 메뉴에서 바이오 포맷가져오기(그림 4A).
참고: Bio-Formats 가져오기자가 이미지 보정을 제대로 인식하는지 확인합니다. 상측 정보 필드 이미지 창에 표시된 그림 차원은 원래 그림 치수(도4B)와같아야 한다. ImageJ/Fiji 소프트웨어에서 이미지 속성을 표시하고 변경하려면 시프트 + P를 누릅니다. - 필요한 경우, 다른 프레임 사이의 조명 보정을 위해 히스토그램 일치26을 사용합니다(이미지 | 조정 | 표백제 보정 | 히스토그램 매칭)(그림 4C).
- 필요한 경우 SIFT 알고리즘(플러그인 | 사용 등록 | 이미지 스택정렬또는 일치를 위한 SIFT와의 선형 스택정렬(그림 4D). 예상 변환 메뉴에서"번역"을선택하면 x-y 드리프트를 수정하기에 충분해야 합니다.
참고: 다른 플러그인을 사용하여 이미지 안정기(https://imagej.net/Image_Stabilizer) 또는 StackReg(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)와 같은 이미지 조각 스택을 정렬할 수도 있습니다. - 기울어진 것을 피하면서 커버슬립에 평행하게 자라는 최해를 선택하십시오. 극확장에 의해 전파되는 최면을 선택하고 측면 및/또는 액면 분기를 제시하는 최해를 피하십시오.
- MTrackJ(플러그인 | 사용 MTrackJ)플러그인 성장 하이팔 팁을 추적(그림 4E)27. 트랙을 추가하려면 도구 모음에서 추가 단추를 선택하고 마우스의 왼쪽 클릭을 사용하여 최면 팁에 첫 번째 점을 배치합니다. 타임 시리즈는 자동으로 다음 프레임으로 이동합니다. 추적 프로세스를 완료하려면 마지막 지점에서 마우스를 두 번 클릭하거나 Esc 키를 누릅니다(그림4F). 초기 시간 프레임에서 다른 관심 지점(즉, 하이팔 팁 증가)으로 이동하여 다른 하이파의 성장률을 측정하여 절차를 다시 시작합니다.
참고: MTrackJ를 설치하려면 https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ 제시된 지침을 따르십시오. - MTrackJ 대화상자(그림 4G)에서 측정 버튼을 클릭하여 출력 테이블을 엽니다. 트랙 측정저장(파일 | 원하는 파일 형식(예: csv)에 저장하고 분석하고 플롯합니다(그림4H).
참고: 동영상 버튼을 선택하면 이미지와 트랙 진행을 보여주는 동영상이 생성됩니다.
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Representative Results
이 프로토콜에 따라 필라멘트 균개 A. nidulans의다양한 성장/발달 단계에 해당하는 다양한 이미지를 캡처하고 분석했습니다. 이 연구에서 제시된 데이터는 피지 소프트웨어를 사용하여 처리되고 분석되었습니다. 측정은 판다, numpy, 통계 모델, matplotlib 및 seaborn과 같은 소프트웨어 라이브러리를 사용하여 상용 통계 소프트웨어 및 /또는 Python 프로그래밍 언어를 사용하여 그래프로 통계적으로 분석하고 준비한 csv 파일로 저장되었습니다. 자세한 내용은 인용된 원본 출판물에서 확인할 수 있습니다.
인구의 반응을 해석하기 위해서는, 인구 내의 주요 매개변수의 이질성을 결정하고 생리학적으로 구별되는 하위집단(28)을효율적으로 식별하는 것이 중요하다. 도 5는 아즈마크 ngnAΔ 돌연변이 균주, 2개의 유전자에서 베어링 삭제의 성장을 나타내며, 그 중 제품은 독성 식물성 L-아제티딘-2-카복실산(29)의 해독 및 동화에 연루되어 WT 균주와 비교하여 나타난다. 침수된 액체 배양에서의 성장률을 측정하여, 우리는 WT 균주(t(715) = 20.61, p = <0,0001)에 비해 이중 돌연변이의 통계적으로 유의한 낮은 성장속도를 검출한다(그림5A-B). 이러한 성장의 차이는 이러한 균주의 식민지 영역(도5C-D)만측정할 수 없었으며, 현미경 단일 세포 분석은 콜로니의 거시적 관찰로 검출하기 어려운 성장률의 작은 차이를 결정하는 데 더 효과적이라는 점을 강조했다.
단일 세포 장기 라이브 이미징은 세포 단백질 역학의 공간 및 측두적인 정보를 얻기 위한 노력에서 중요한 가치입니다. GFP 라벨코어 아이소소말 단백질 필라와 mRFP 히스톤 H1을 공동 발현하는 원전 발아의 장기 라이브 세포이미징(도 6,비디오 1)은PilA30이 곰팡이 플라즈마 멤브레인31,32에서낮은 이동성을 가진 정적 구조를 형성한다는 것을 보여준다. 더욱이, 도 7은 세포기관과 세포 구조의 역학을 연구하기 위해, 천 배지에서 자란 균주의 실시간 이미징에 형광 염료를 사용할 수 있음을 보여줍니다. 여기서, FM4-6433은 A. nidulans에서 미토콘드리아 네트워크 및 vacuolar 시스템을 시각화하는 데 사용되었다.
그림 1: 접종 준비 절차의 회로도 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 한천 배지에서 자라는 필라멘트 곰팡이를 이미징하는 절차의 회로도 표현.
그림 3: 액체 배지에서 자라는 화상 진찰 필라멘트 곰팡이에 대한 절차의 회로도 표현.
그림 4: 이미지 분석 절차의 회로도 표현. 시간 경과 현미경 이미지를 처리하고 A. nidulans의성장률을 측정하기위한 단계 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 전통적인 인구 측정을 단일 셀 측정과 비교합니다. (A)25°C에서 단독 질소 원으로 우레아를 함유하는 침수된 액체 배양에서 자란 아즈AΔ ngnAΔ 이중 삭제 및 WT 균주의 대표적인 공초점 현미경 이미지. 모든 균주는 총 18시간 동안 배양되었고, 25°C에서 프레임은 15분 간격으로 포획되었다. 2048× 2048픽셀의 이미지는 HC 플랜 APO 63x, N.A. 1.40 오일 침지 목표를 갖춘 TCS SP8 MP(라이카, 독일) 현미경을 사용하여 115.02 x 115.02 nm의 픽셀 크기로 수집되었습니다. (B)(A)의측정은 상자와 수염 플롯에 플롯된다. 통계적 유의성은 t-Test를 통해 분석되었으며 별표(***)로 묘사되어 p < 0.001을 나타냅니다. (C)WT의 25°C에서 성장하고 고체 MM에 대한 이중 삭제 변형률(18h, 36h 및 72h)으로 촬영되었으며, ImageJ 프로그램에서 눈금자와 수동으로 공간 적으로 보정및 측정하였다. (D)(C)에제시된 콜로니 영역의 측정은 상자와 수염 플롯으로 플롯된다. 콜로니 영역의 차이는 WT 균주(18h: t(8) = 0.69, p = 0.50, 36h: t(6) = 0.27, p = 0.5068, 72h: t(6) = 0.39, p=0.39, p.70에 비해 이중 돌연변이의 상이한 시간점 사이에 통계적으로 유의하지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 유전적으로 인코딩된 형광태그와 융합된 관심의 공동 발아 단백질을 동시 발아하는 장기 라이브 세포 이미징. (A)Z 평면에서 생성된 4개의 슬라이스의 최대 강도 투영(MIP)은 필라-GFP 및 H1-mRFP를 공동 발현하는 스트레인의 한천 배지에서 발견되어 30°C에서 약 1시간 동안 배양하여 한천에 세포의 접착을 돕는다. 코니디아를 함유한 한천 블록은 슬라이스되어 μ 슬라이드의 우물에 배치되어 30°C에서 총 18시간 동안 배양되었다. 프레임은 HC 플랜 APO 63x, N.A. 1.40 오일 침지 목표(픽셀 크기 92.26 x 92.26 nm)를 탑재한 TCS SP8 MP(Leica, Germany) 현미경을 사용하여 25분 간격으로 캡처되었습니다. 이미지는 488-nm 파장에서 흥미로운 GFP에 의해 얻어졌으며 495에서 558 nm에 이르는 스펙트럼 대역에서 형광을 감지하고 561-nm 파장에서 흥미로운 mRFP를 통해 580에서 660nm에 이르는 스펙트럼 밴드의 형광을 검출했습니다. (B)(A)의측정(발아 및 최면 팁 연장의 속도)은 선 그래프로 플로팅됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 고체 배지에서 성장하는 하이피의 FM4-64 라벨링. WT 균주의 코니디아는 30°C에서 16h의 16h의 천MM 페트리 요리로 재배하였다. 성장하는 배아는 10 μM FM4-64를 포함하는 MM의 10 μL로 20 분 동안 배양되었습니다. 인큐베이션에 이어, 스테인드 배아를 함유한 한천 블록을 얇게 썰어 8 μ 슬라이드로, 30°C에서 47분 추격전을 펼쳤다. 프레임은 HC 플랜 APO 63x, N.A. 1.40 오일 침지 목표(픽셀 크기 184.52 x 184.52 nm)를 장착한 TCS SP8 MP 현미경을 사용하여 30°C에서 7분마다 포획하였다. 이미지는 514-nm 파장에서 흥미진진한 FM4-64에 의해 얻어졌으며 596에서 682 nm에 이르는 스펙트럼 대역에서 형광을 검출했습니다. FM4-64 형광 신호는 반전된 이미지로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: conidiophore 형성의 초기 단계. (A)WT 균주의 코니디아는 30 °C에서 136 시간 동안 한천 배지에서 배양되어 μ 슬라이드의 우물에 배치하였다. 프레임은 20분마다 캡처되었습니다. 2048× 2048픽셀의 이미지는 HC 플랜 APO 63x, N.A. 1.40 오일 침지 목표를 갖춘 TCS SP8 MP(라이카, 독일) 현미경을 사용하여 245.2 x 245.2 nm의 픽셀 크기로 수집되었습니다. 이미지는 조개포소포(검은 화살)의 형성과 메툴라(파란색 화살표)의 형성(갈색 화살표) 및 성숙을 보여줍니다. (B)(A)의 측정(발아 속도 및 단극성 최음팁 연장)은 선 그래프로 플로팅된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: PilA-GFP 및 H1-mRFP를 공동 발현하는 동시 발아의 장기 라이브 셀 이미징이 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2: 코니디오포어 포메이션 A. 니둘란스의 초기 단계.
그림 S1: 간원정지 준비. 멸균 이쑤시개를 긁어 서 약 1cm2 표면의 코니디아 플레이트, 약 2 x 106 코니디아/ml의 현탁액이 얻어진다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
시간 경과 현미경 검사법에 의한 곰팡이 세포 성장 및 표현형을 모니터링하는 것은 특정 약물 치료 및/또는 유전 적 개입이 시간이 지남에 따라 검출 가능한 세포 성장 또는 표현성 차이의 결과인지 여부를 실시간으로 정량적으로 정확하게 결정하는 강력한 접근법입니다.
본 연구에서는, 신뢰할 수 있는 살아있는 세포 이미징 방법론이 A. nidulans에서세균관및 최면 팁 성장의 역학을 포함하여 곰팡이 발달을 측정하고 정량적으로 분석하기 위하여 기술되었다. 전송된 빛 현미경 기술을 사용하여 시간이 지남에 따라 형태학적 변화를 모니터링하는 것은 스트레스, 죽거나 죽은 세포를 식별하는 데 매우 유용할 수 있습니다. 단세포 수준에서 이러한 동적 프로세스에 대한 상세한 지식은 세포의 혼합 인구 내와 오랜 관점에서 이질성을 평가할 수 있게 해주며, 세포가 내인성 및 환경 신호에 반응하는 경로 및 상세한 메커니즘의 식별을 허용합니다.
이 방법의 한 가지 장점은 세포의 고유 빛 굴절 특성을 사용하여 결과를 혼동 할 수있는 염료 / 라벨을 도입하지 않고 이미지 대비를 만드는 라벨 무료 이미징 접근 법 (그럼에도 불구하고 형광 현미경 검사법과 쉽게 결합 될 수 있음)을 기반으로한다는 것입니다. 형광 마커는 세포 구획과 단백질에 태그를 지정하고 세포의 세분화 및 추적을 현저하게 용이하게하는 데 사용할 수 있지만, 전달 된 빛 현미경 검사는 유전 공학 세포의 필요성을 우회하여 연구자가 비용과 시간이 많이 소요되는 염료 /라벨 최적화를 피하고 또한 형광 이미징13, 34에서나오는 가능한 광독성 효과를 피할 수 있게합니다.
이 프로토콜은 최면 또는 의사 수면을 형성하는 균류의 성장 역학을 연구하기에 적합합니다. 더욱이, 이 접근은 다른 긴장의 다른 세포 구조물 및 다른 발달 단계의 화상 진찰에 매우 적합합니다. 그림 8 및 비디오 2에서는 A. nidulans conidiophore (즉, 무성 포자를 베어링 구조) 개발의 초기 단계를 제시합니다. 그러나, 이 방법은 방탄소년단 형성에 가장 적합하지 않다는 점에 유의해야 하며, 탄소/질소 기아와 공기 노출은 모두 포니오포어 의 개발에 필요한 것이 우리의접근법(35)에의해 표준화될 수 없기 때문이다.
또한, 본 프로토콜은 필라멘트 최면, 의사효세포, 효모형 세포 및 다양한 형태의 세포외매트릭스(36)로구성된 조밀한 이질, 표면 관련 콜로니를 형성하는 수직 확장의 대상이 되는 곰팡이 생물막을 추적하는 데 적합하지 않다. 기술의 또 다른 한계는 라벨 무료 현미경 분석이 발아/분화 역학의 질적 및 정량적 분석을 위한 정확한 방법을 나타내지만, 이러한 데이터의 수동 평가는 특히 많은 균주 또는/및 조건을 검사할 때 시간이 많이 소요된다는 것입니다. 따라서, 고처리량 시간 경과 이미징 현미경 검사법의 데이터는 최면 발달 및 간질발아37,38,39의자동 또는 반자동 이미지 분석을 가능하게 하는 적합한 전산 소프트웨어에 의해 분석되어야 한다.
요약하자면, 당사는 사용자로부터 의전한 이미지 분석 경험이 필요 없이 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 방식으로 곰팡이 성장 운동학을 분석하기 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 곰팡이 성장과 분화의 객관적이고 정확한 정량화를 허용하고, 곰팡이 수명 주기 및 곰팡이 병원성37을연구하는 보완적인 이미징 접근법을 제공한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 사업은 운영 프로그램 "경쟁력, 기업가 정신 및 혁신"(NSRF 2014-2020)의 자금 지원및 그리스와 EU의 공동 자금 지원을 통해 "연구 혁신 인프라 강화"(MIS)라는 "기초 생물학적 프로세스(BioImaging-GR)"(BioImaging-GR)를 시각화하고 모니터링하기 위한 그리스 연구 인프라"(MIS 5002755)의 프로젝트에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
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