מדידת שטף מצע מיטוכונדריאלי בתאים פרומינגוליסין O-פרמיבילים
Summary
בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול שונה כדי לבדוק שטף מצע נשימתי מיטוכונדריאלי באמצעות רקומביננטי perfringolysin O בשילוב עם רזפירומטריה מבוססת מיקרופלסטיק. עם פרוטוקול זה, אנו מראים כיצד מטפורמין משפיע על נשימה מיטוכונדריאלית של שני קווי תאים סרטניים שונים.
Abstract
שטף מצע מיטוכונדריאלי הוא מאפיין בולט של כל סוג תא, ושינויים במרכיביו כגון מובילים, ערוצים או אנזימים מעורבים בפתוגנזה של מספר מחלות. ניתן לחקור שטף מצע מיטוכונדריאלי באמצעות תאים שלמים, תאים מחלחלים או מיטוכונדריה מבודדת. חקירת תאים שלמים נתקלת במספר בעיות עקב חמצון סימולטני של מצעים שונים. חוץ מזה, מספר סוגי תאים מכילים מאגרים פנימיים של מצעים שונים שמסבך את פרשנות התוצאות. שיטות כגון בידוד מיטוכונדריאלי או שימוש בסוכנים מחלחלים אינם ניתנים לשחזור בקלות. בידוד המיטוכונדריה הטהורה עם ממברנות שלמות בכמויות מספיקות מדגימות קטנות הוא בעייתי. שימוש permeabilizers לא סלקטיבי גורם דרגות שונות של נזק ממברנה מיטוכונדריאלית בלתי נמנע. רקומביננטי perfringolysin O (rPFO) הוצע כמו permeabilizer מתאים יותר, הודות ליכולתו באופן סלקטיבי permeabilize קרום פלזמה מבלי להשפיע על שלמות המיטוכונדריה. כאשר נעשה שימוש בשילוב עם respirometry microplate, זה מאפשר בדיקת השטף של כמה מצעים מיטוכונדריאליים עם מספיק שכפולים בתוך ניסוי אחד תוך שימוש במספר מינימלי של תאים. בעבודה זו, הפרוטוקול מתאר שיטה להשוות שטף מצע מיטוכונדריאלי של שני פנוטיפים תאיים שונים או גנוטיפים וניתן להתאים אישית כדי לבדוק מצעים או מעכבים מיטוכונדריאליים שונים.
Introduction
ספירומטריה מבוססת מיקרופלסטיק חוללה מהפכה במחקר המיטוכונדריאלי בכך שאפשרה את חקר הנשימה התאית בגודל מדגם קטן1. נשימה תאית נחשבת בדרך כלל כאינדיקטור לתפקוד מיטוכונדריאלי או “תפקוד לקוי”, למרות העובדה כי טווח הפונקציות המיטוכונדריאלי משתרע מעבר לייצוראנרגיה 2. בתנאים אירוביים, המיטוכונדריה מחלצים את האנרגיה המאוחסנת במצעים שונים על ידי פירוק והמרת מצעים אלה למתווכים מטבוליים שיכולים לתדלק את מחזור חומצת לימון3 (איור 1). השטף המתמשך של המצעים חיוני לזרימה של מחזור חומצת לימון כדי ליצור אנרגיה גבוהה ‘תורמי אלקטרונים’, אשר מספקים אלקטרונים לשרשרת הובלת האלקטרונים המייצר שיפוע פרוטונים על פני הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית, ומאפשר ATP-סינתאז לזרחן ADP ל- ATP4. לכן, עיצוב ניסיוני כדי לעצור נשימה מיטוכונדריאלית חייב לכלול את טבע המדגם (תאים שלמים, תאים מחלחלים, או מיטוכונדריה מבודדת) ומצעים מיטוכונדריאליים.
תאים לשמור על מאגר של מצעים ילידים5, ומיטוכונדריה לחמצן כמה סוגים של מצעים בו זמנית6, אשר מסבך את הפרשנות של תוצאות המתקבלות מניסויים שבוצעו על תאים שלמים. גישה נפוצה לחקור את היכולת המיטוכונדריאלית לחמצן מצע נבחר היא לבודד את המיטוכונדריה או לחלחל לתאים הנחקרים5. למרות המיטוכונדריה מבודדת הם אידיאליים עבור מחקרים כמותיים, תהליך הבידוד הוא מייגע. הוא מתמודד עם קשיים טכניים כגון הצורך בגודל מדגם גדול, טוהר התשואה, ושחזור של הטכניקה5. תאים מחלחלים מציעים פתרון לחסרונות של בידוד מיטוכונדריאלי; עם זאת, חומרים מחלחלים שגרתיים של טבע דטרגנט אינם ספציפיים ועלולים לפגוע בממברנות המיטוכונדריאליות5.
רקומביננטי perfringolysin O (rPFO) הוצע כקרום פלזמה סלקטיבי מחלחל סוכן7, והוא שימש בהצלחה בשילוב עם מנתח שטף חוץ תאי במספר מחקרים7,8,9,10. שינינו פרוטוקול באמצעות rPFO כדי לסנן שטף מצע מיטוכונדריאלי באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי XFe96. בפרוטוקול זה, ארבעה מסלולים שונים חמצון מצע בשני פנוטיפים הסלולר משווים תוך שיש מספיק שכפולים ואת השליטה הנכונה עבור כל חומר נבדק.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה הוא שינוי של מחקרים שפורסמו בעבר7,8,9,10 ואת מדריך המשתמש במוצר. בניגוד לפרוטוקול היצרן, 2x MAS משמש במקום 3x MAS, שכן 2× MAS קל יותר להתמוסס ואינו יוצר משקעים לאחר הקפאה. ניתן לאחסן עד שישה חודשים ולהראות תוצאות עקביות…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לחברי הצוות של המחלקה לפיזיולוגיה בפקולטה לרפואה בחרדק קרלובה ולמחלקה לפתופיזיולוגיה בפקולטה השלישית לרפואה על העזרה בהכנת כימיקלים ודגימות. עבודה זו נתמכה על ידי תוכניות המענקים של אוניברסיטת צ’ארלס PROGRES Q40/02, משרד הבריאות הצ’כי מענק NU21-01-00259, קרן המדע הצ’כית מענק 18-10144 ופרויקט INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 במימון משרד החינוך, הנוער והספורט של צ’כיה ועל ידי האיחוד האירופי.
Materials
| Adinosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 – 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnissium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 – 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) – Aliquot and store at -20 °C |
References
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
- Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics 3. , (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).
- Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).
