Rekombinant Perfringolysin O-Permeabilized Hücrelerde Mitokondriyal Substrat Akılarının Ölçülmesi
Summary
Bu çalışmada, mikro plaka bazlı respirometri ile birlikte rekombinant perfringolysin O kullanarak mitokondriyal solunum substrat akısını test etmek için değiştirilmiş bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol ile metforminin iki farklı tümör hücre hattının mitokondriyal solunumunu nasıl etkilediğini gösteriyoruz.
Abstract
Mitokondriyal substrat akısı her hücre tipinin ayırt edici bir özelliğidir ve taşıyıcılar, kanallar veya enzimler gibi bileşenlerindeki değişiklikler birkaç hastalığın patogenezinde rol oynar. Mitokondriyal substrat akısı bozulmamış hücreler, permeabilize hücreler veya izole mitokondri kullanılarak incelenebilir. Sağlam hücrelerin araştırılması, farklı substratların eşzamanlı oksidasyonu nedeniyle çeşitli sorunlarla karşılaşır. Ayrıca, birkaç hücre türü, sonuç yorumlamayı zorlaştıran farklı substratların iç depolarını içerir. Mitokondriyal izolasyon veya permeabilize edici ajanlar kullanma gibi yöntemler kolayca tekrarlanamaz. Saf mitokondrilerin küçük örneklerden yeterli miktarda bozulmamış zarlarla izole edilmesi sorunludur. Seçici olmayan permeabilizatörlerin kullanılması, çeşitli derecelerde kaçınılmaz mitokondriyal membran hasarına neden olur. Rekombinant perfringolysin O (rPFO), mitokondriyal bütünlüğü etkilemeden plazma membranını seçici olarak permeabilize etme yeteneği sayesinde daha uygun bir permeabilizatör olarak sunuldu. Mikro plaka respirometrisi ile birlikte kullanıldığında, birkaç mitokondriyal substratın akısının en az sayıda hücre kullanırken bir deneyde yeterli çoğaltma ile testine izin verir. Bu çalışmada, protokol iki farklı hücresel fenotip veya genotipin mitokondriyal substrat akısını karşılaştırmak için bir yöntem açıklar ve çeşitli mitokondriyal substratları veya inhibitörleri test etmek için özelleştirilebilir.
Introduction
Mikro plaka bazlı respirometri, küçük bir örneklem boyutunun hücresel solunumunun incelenmesini sağlayarak mitokondriyal araştırmalarda devrim yaptı1. Hücresel solunum genellikle mitokondriyal fonksiyonun veya ‘işlev bozukluğunun’ bir göstergesi olarak kabul edilir, ancak mitokondriyal fonksiyon aralığı enerji üretiminin ötesine uzanır2. Aerobik koşullarda mitokondriler, bu substratları parçalayarak ve sitrik asit döngüsünü körükleyebilecek metabolik ara parçalara dönüştürerek farklı substratlarda depolanan enerjiyi çıkarır3 (Şekil 1). Substratların sürekli akışı, sitrik asit döngüsünün akışının, iç mitokondriyal membran boyunca proton gradyanı üreten elektron taşıma zincirine elektronlar sağlayan ve ATP-synthase’in ADP’yi ATP4’efosforilasyon yapmasını sağlayan yüksek enerjili ‘elektron donörleri’ üretmesi için gereklidir. Bu nedenle, mitokondriyal solunumu test etmek için deneysel bir tasarım, örnek doğayı (bozulmamış hücreler, permeabilize hücreler veya izole mitokondriler) ve mitokondriyal substratları içermelidir.
Hücreler yerli substratların bir deposu tutar5ve mitokondri aynı anda çeşitli substrat türlerini oksitler6, bu da sağlam hücreler üzerinde yapılan deneylerden elde edilen sonuçların yorumlanmasını zorlaştırır. Seçilen bir substratı oksitlemek için mitokondriyal yeteneği araştırmak için yaygın bir yaklaşım mitokondri izole etmek veya araştırılan hücrelerin dengesini sağlamaktır5. İzole mitokondri nicel çalışmalar için ideal olsa da izolasyon süreci zahmetlidir. Büyük numune boyutu ihtiyacı, verimin saflığı ve tekniğin tekrarlanabilirliği gibi teknik zorluklarla karşıkarşıyadır 5. Permeabilize hücreler mitokondriyal izolasyonun dezavantajları için bir çözüm sunar; bununla birlikte, deterjan doğasının rutin permeabilize edici ajanları spesifik değildir ve mitokondriyal membranlara zarar verebilir5.
Rekombinant perfringolysin O (rPFO) seçici plazma membran permeabilizasyon ajanı7olarak sunuldu ve çeşitli çalışmalarda hücre dışı bir akı analizörü ile birlikte başarıyla kullanıldı 7,8,9,10. XFe96 hücre dışı akı çözümleyicisi kullanarak mitokondriyal substrat akısını taramak için rPFO kullanarak bir protokol değiştirdik. Bu protokolde, iki hücresel fenotipte dört farklı substrat oksitleyici yol, test edilen her malzeme için yeterli çoğaltma ve uygun kontrole sahipken karşılaştırılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, daha önce yayınlanan7,8,9,10 çalışmalarının ve ürün kullanım kılavuzunun bir modifikasyonudur. Üreticinin protokolünün aksine, 3x MAS yerine 2x MAS kullanılır, çünkü 2× MAS’ın çözülmesi daha kolaydır ve donma sonrasında yağış oluşturmaz. Dondurulmuş 2x MAS aliquots altı aya kadar saklanabilir ve tutarlı sonuçlar gösterebilir. Diğer bir fark, ADP’…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Hradec Králové Tıp Fakültesi Fizyoloji Bölümü ve Üçüncü Tıp Fakültesi Patofizyoloji Bölümü personeline kimyasallar ve numunelerin hazırlanması konusundaki yardımlarından dolayı teşekkür ediyor. Bu çalışma Charles Üniversitesi hibe programları PROGRES Q40/02 tarafından desteklenmiştir, Çek Sağlık Bakanlığı hibe NU21-01-00259, Çek bilim vakfı hibe 18-10144 ve INOMED projesi CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 Çek Cumhuriyeti Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı ve Avrupa Birliği tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Adinosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 – 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnissium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 – 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) – Aliquot and store at -20 °C |
References
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
- Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics 3. , (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).
- Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).
