Misurazione del flusso del substrato mitocondriale in cellule ricombinanti perfringolisina O-permeabilizzate
Summary
In questo lavoro, descriviamo un protocollo modificato per testare il flusso del substrato respiratorio mitocondriale utilizzando la perfringolisina O ricombinante in combinazione con la respirometria basata su micropiastre. Con questo protocollo, mostriamo come la metformina influisce sulla respirazione mitocondriale di due diverse linee cellulari tumorali.
Abstract
Il flusso del substrato mitocondriale è una caratteristica distintiva di ciascun tipo di cellula e i cambiamenti nei suoi componenti come trasportatori, canali o enzimi sono coinvolti nella patogenesi di diverse malattie. Il flusso del substrato mitocondriale può essere studiato utilizzando cellule intatte, cellule permeabilizzate o mitocondri isolati. Lo studio delle cellule intatte incontra diversi problemi a causa dell’ossidazione simultanea di diversi substrati. Inoltre, diversi tipi di cellule contengono depositi interni di diversi substrati che complicano l’interpretazione dei risultati. Metodi come l’isolamento mitocondriale o l’uso di agenti permeabilizzanti non sono facilmente riproducibili. Isolare i mitocondri puri con membrane intatte in quantità sufficienti da piccoli campioni è problematico. L’uso di permeabilizzanti non selettivi provoca vari gradi di inevitabile danno alla membrana mitocondriale. La perfringolisina ricombinante O (rPFO) è stata offerta come permeabilizzante più appropriato, grazie alla sua capacità di permeabilizzare selettivamente la membrana plasmatica senza compromettere l’integrità mitocondriale. Se utilizzato in combinazione con la respirometria a micropiastre, consente di testare il flusso di diversi substrati mitocondriali con abbastanza repliche all’interno di un esperimento utilizzando un numero minimo di cellule. In questo lavoro, il protocollo descrive un metodo per confrontare il flusso del substrato mitocondriale di due diversi fenotipi cellulari o genotipi e può essere personalizzato per testare vari substrati o inibitori mitocondriali.
Introduction
La respirometria basata su micropiastre ha rivoluzionato la ricerca mitocondriale consentendo lo studio della respirazione cellulare di un campione di piccole dimensioni1. La respirazione cellulare è generalmente considerata un indicatore della funzione mitocondriale o “disfunzione”, nonostante il fatto che la gamma di funzioni mitocondriali si estenda oltre la produzione di energia2. In condizioni aerobiche, i mitocondri estraggono l’energia immagazzinata in diversi substrati scomponendo e convertendo questi substrati in intermedi metabolici che possono alimentare il ciclo dell’acido citrico3 (Figura 1). Il flusso continuo di substrati è essenziale per il flusso del ciclo dell’acido citrico per generare “donatori di elettroni” ad alta energia, che forniscono elettroni alla catena di trasporto degli elettroni che genera un gradiente protonico attraverso la membrana mitocondriale interna, consentendo all’ATP-sintasi di fosforilare ADP in ATP4. Pertanto, un progetto sperimentale per analizzare la respirazione mitocondriale deve includere la natura del campione (cellule intatte, cellule permeabilizzate o mitocondri isolati) e substrati mitocondriali.
Le cellule mantengono una riserva di substrati indigeni5e i mitocondri ossidano diversi tipi di substrati contemporaneamente6,il che complica l’interpretazione dei risultati ottenuti da esperimenti eseguiti su cellule intatte. Un approccio comune per studiare la capacità mitocondriale di ossidare un substrato selezionato è quello di isolare i mitocondri o permeabilizzare le cellule studiate5. Sebbene i mitocondri isolati siano ideali per studi quantitativi, il processo di isolamento è laborioso. Affronta difficoltà tecniche come la necessità di grandi dimensioni del campione, la purezza della resa e la riproducibilità della tecnica5. Le cellule permeabilizzate offrono una soluzione per gli svantaggi dell’isolamento mitocondriale; tuttavia, gli agenti permeabilizzanti di routine di natura detergente non sono specifici e possono danneggiare le membrane mitocondriali5.
La perfringolisina ricombinante O (rPFO) è stata offerta come agente permeabilizzante selettivo della membrana plasmatica7ed è stata utilizzata con successo in combinazione con un analizzatore di flusso extracellulare in diversi studi7,8,9,10. Abbiamo modificato un protocollo che utilizza rPFO per lo screening del flusso del substrato mitocondriale utilizzando l’analizzatore di flusso extracellulare XFe96. In questo protocollo, vengono confrontate quattro diverse vie ossidanti del substrato in due fenotipi cellulari pur avendo repliche sufficienti e il controllo adeguato per ciascun materiale testato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è una modifica degli studi precedentemente pubblicati7,8,9,10 e della guida per l’utente del prodotto. A differenza del protocollo del produttore, viene utilizzato 2x MAS invece di 3x MAS, poiché 2× MAS è più facile da sciogliere e non forma precipitazioni dopo il congelamento. Le aliquote MAS congelate 2x possono essere conservate fino a sei mesi e mostrare risultati coe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano i membri dello staff del Dipartimento di Fisiologia della Facoltà di Medicina di Hradec Králové e del Dipartimento di Fisiopatologia della Terza Facoltà di Medicina per l’aiuto con le sostanze chimiche e la preparazione dei campioni. Questo lavoro è stato supportato dai programmi di sovvenzione della Charles University PROGRES Q40/02, dalla sovvenzione del Ministero della Salute ceco NU21-01-00259, dalla sovvenzione della fondazione scientifica ceca 18-10144 e dal progetto INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 finanziato dal Ministero dell’Istruzione, della Gioventù e dello Sport della Repubblica Ceca e dall’Unione Europea.
Materials
| Adinosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 – 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnissium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 – 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) – Aliquot and store at -20 °C |
References
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