Mesure du flux de substrat mitochondrial dans les cellules O-perméabilisées de perfringolysine recombinante
Summary
Dans ce travail, nous décrivons un protocole modifié pour tester le flux de substrat respiratoire mitochondrial en utilisant la perfringolysine O recombinante en combinaison avec la respirométrie à base de microplaques. Avec ce protocole, nous montrons comment la metformine affecte la respiration mitochondriale de deux lignées cellulaires tumorales différentes.
Abstract
Le flux de substrat mitochondrial est une caractéristique distinctive de chaque type de cellule, et des changements dans ses composants tels que les transporteurs, les canaux ou les enzymes sont impliqués dans la pathogenèse de plusieurs maladies. Le flux de substrat mitochondrial peut être étudié à l’aide de cellules intactes, de cellules perméabilisées ou de mitochondries isolées. L’étude de cellules intactes rencontre plusieurs problèmes dus à l’oxydation simultanée de différents substrats. En outre, plusieurs types de cellules contiennent des réserves internes de différents substrats qui compliquent l’interprétation des résultats. Les méthodes telles que l’isolement mitochondrial ou l’utilisation d’agents perméabilisants ne sont pas facilement reproductibles. Isoler des mitochondries pures avec des membranes intactes en quantité suffisante à partir de petits échantillons est problématique. L’utilisation de perméabilisateurs non sélectifs provoque divers degrés de dommages inévitables à la membrane mitochondriale. La perfringolysine O recombinante (FPSR) a été proposée comme perméabilisant plus approprié, grâce à sa capacité à perméabiliser sélectivement la membrane plasmique sans affecter l’intégrité mitochondriale. Lorsqu’il est utilisé en combinaison avec la microflamétrie, il permet de tester le flux de plusieurs substrats mitochondriaux avec suffisamment de répliques dans une expérience tout en utilisant un nombre minimal de cellules. Dans ce travail, le protocole décrit une méthode pour comparer le flux de substrat mitochondrial de deux phénotypes ou génotypes cellulaires différents et peut être personnalisé pour tester divers substrats ou inhibiteurs mitochondriaux.
Introduction
La respirométrie à base de microplaques a révolutionné la recherche mitochondriale en permettant l’étude de la respiration cellulaire d’un échantillon de petite taille1. La respiration cellulaire est généralement considérée comme un indicateur de la fonction mitochondriale ou du « dysfonctionnement », malgré le fait que la gamme mitochondriale des fonctions s’étend au-delà de la production d’énergie2. Dans des conditions aérobies, les mitochondries extraient l’énergie stockée dans différents substrats en décomposant et en convertissant ces substrats en intermédiaires métaboliques pouvant alimenter le cycle de l’acide citrique3 (Figure 1). Le flux continu de substrats est essentiel pour que le flux du cycle de l’acide citrique génère des « donneurs d’électrons » à haute énergie, qui délivrent des électrons à la chaîne de transport d’électrons qui génère un gradient de protons à travers la membrane mitochondriale interne, permettant à l’ATP-synthase de phosphoryler ADP en ATP4. Par conséquent, une conception expérimentale pour tester la respiration mitochondriale doit inclure la nature de l’échantillon (cellules intactes, cellules perméabilisées ou mitochondries isolées) et les substrats mitochondriaux.
Les cellules conservent un stock de substrats indigènes5, et les mitochondries oxydent plusieurs types de substrats simultanément6, ce qui complique l’interprétation des résultats obtenus à partir d’expériences réalisées sur des cellules intactes. Une approche courante pour étudier la capacité mitochondriale à oxyder un substrat sélectionné consiste à isoler les mitochondries ou à perméabiliser les cellules étudiées5. Bien que les mitochondries isolées soient idéales pour les études quantitatives, le processus d’isolement est laborieux. Il fait face à des difficultés techniques telles que la nécessité d’un échantillon de grande taille, la pureté du rendement et la reproductibilité de la technique5. Les cellules perméabilisées offrent une solution aux inconvénients de l’isolement mitochondrial; cependant, les agents perméabilisants de routine de nature détergente ne sont pas spécifiques et peuvent endommager les membranes mitochondriales5.
La perfringolysine O recombinante (FPSR) a été proposée comme agent sélectif de perméabilisation de la membraneplasmique 7,et elle a été utilisée avec succès en association avec un analyseur de flux extracellulaire dans plusieurs études7,8,9,10. Nous avons modifié un protocole utilisant rPFO pour filtrer le flux de substrat mitochondrial à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire XFe96. Dans ce protocole, quatre voies d’oxydation de substrat différentes dans deux phénotypes cellulaires sont comparées tout en ayant suffisamment de répliques et le contrôle approprié pour chaque matériau testé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole est unemodification des études7,8,9,10 publiées précédemment et du guide de l’utilisateur du produit. Contrairement au protocole du fabricant, 2x MAS est utilisé au lieu de 3x MAS, car 2× MAS est plus facile à dissoudre et ne forme pas de précipitations après le gel. Les aliquotes MAS congelées 2x peuvent être conservées jusqu’à six mois et montrent des résultats …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient les membres du personnel du Département de physiologie de la Faculté de médecine de Hradec Králové et du Département de physiopathologie de la Troisième Faculté de médecine pour leur aide à la préparation des produits chimiques et des échantillons. Ce travail a été soutenu par les programmes de subventions de l’Université Charles PROGRES Q40/02, la subvention du ministère tchèque de la Santé NU21-01-00259, la subvention de la Fondation tchèque pour la science 18-10144 et le projet INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 financé par le ministère de l’Éducation, de la Jeunesse et des Sports de la République tchèque et par l’Union européenne.
Materials
| Adinosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 – 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnissium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 – 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) – Aliquot and store at -20 °C |
References
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