Messung des mitochondrialen Substratflusses in rekombinanten Perfringolysin O-permeabilisierten Zellen

Summary

In dieser Arbeit beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll zum Testen des mitochondrialen respiratorischen Substratflusses unter Verwendung von rekombinantem Perfringolysin O in Kombination mit mikroplattenbasierter Respirometrie. Mit diesem Protokoll zeigen wir, wie Metformin die mitochondriale Atmung von zwei verschiedenen Tumorzelllinien beeinflusst.

Abstract

Der mitochondriale Substratfluss ist ein Unterscheidungsmerkmal jedes Zelltyps, und Veränderungen seiner Komponenten wie Transporter, Kanäle oder Enzyme sind an der Pathogenese mehrerer Krankheiten beteiligt. Mitochondrialer Substratfluss kann mit intakten Zellen, permeabilisierten Zellen oder isolierten Mitochondrien untersucht werden. Die Untersuchung intakter Zellen stößt aufgrund der gleichzeitigen Oxidation verschiedener Substrate auf mehrere Probleme. Außerdem enthalten mehrere Zelltypen interne Speicher verschiedener Substrate, die die Interpretation der Ergebnisse erschweren. Methoden wie die mitochondriale Isolierung oder die Verwendung von Permeabilisatoren sind nicht leicht reproduzierbar. Die Isolierung reiner Mitochondrien mit intakten Membranen in ausreichenden Mengen aus kleinen Proben ist problematisch. Die Verwendung von nicht-selektiven Permeabilisatoren verursacht verschiedene Grade unvermeidlicher mitochondrialer Membranschäden. Rekombinantes Perfringolysin O (rPFO) wurde dank seiner Fähigkeit, die Plasmamembran selektiv zu permeabilisieren, ohne die mitochondriale Integrität zu beeinträchtigen, als geeigneterer Permeabilisator angeboten. In Kombination mit der Mikroplatten-Respirometrie ermöglicht es, den Fluss mehrerer mitochondrialer Substrate mit genügend Replikaten innerhalb eines Experiments unter Verwendung einer minimalen Anzahl von Zellen zu testen. In dieser Arbeit beschreibt das Protokoll eine Methode zum Vergleich des mitochondrialen Substratflusses von zwei verschiedenen zellulären Phänotypen oder Genotypen und kann angepasst werden, um verschiedene mitochondriale Substrate oder Inhibitoren zu testen.

Introduction

Die Mikroplatten-basierte Respirometrie hat die mitochondriale Forschung revolutioniert, indem sie die Untersuchung der Zellatmung einer kleinen Stichprobengröße^{ermöglicht 1}. Die Zellatmung wird im Allgemeinen als Indikator für die mitochondriale Funktion oder “Dysfunktion” angesehen, obwohl der mitochondriale Funktionsumfang über die Energieproduktion hinausgeht². Unter aeroben Bedingungen extrahieren Mitochondrien die in verschiedenen Substraten gespeicherte Energie, indem sie diese Substrate abbauen und in metabolische Zwischenprodukte umwandeln, die den Zitronensäurezyklus³ antreiben können (Abbildung 1). Der kontinuierliche Fluss von Substraten ist essentiell für den Fluss des Zitronensäurezyklus, um hochenergetische “Elektronendonatoren” zu erzeugen, die Elektronen an die Elektronentransportkette liefern, die einen Protonengradienten über die innere mitochondriale Membran erzeugt, so dass die ATP-Synthase ADP zu ATP⁴phosphorylieren kann. Daher muss ein experimentelles Design zur Untersuchung der mitochondrialen Atmung die Probennatur (intakte Zellen, permeabilisierte Zellen oder isolierte Mitochondrien) und mitochondriale Substrate umfassen.

Zellen halten einen Vorrat an einheimischen Substraten⁵, und Mitochondrien oxidieren mehrere Arten von Substraten gleichzeitig⁶, was die Interpretation von Ergebnissen aus Experimenten an intakten Zellen erschwert. Ein gängiger Ansatz zur Untersuchung der mitochondrialen Fähigkeit, ein ausgewähltes Substrat zu oxidieren, besteht darin, Mitochondrien zu isolieren oder die untersuchten Zellen zu permeabilisieren⁵. Obwohl isolierte Mitochondrien ideal für quantitative Studien sind, ist der Isolationsprozess mühsam. Es steht vor technischen Schwierigkeiten wie der Notwendigkeit eines großen Stichprobenumfangs, der Reinheit der Ausbeute und der Reproduzierbarkeit der Technik⁵. Permeabilisierte Zellen bieten eine Lösung für die Nachteile der mitochondrialen Isolierung; Routinemäßige Permeabilisatoren der Detergenziennatur sind jedoch nicht spezifisch und können die mitochondrialen Membranen schädigen⁵.

Rekombinantes Perfringolysin O (rPFO) wurde als selektives Plasmamembranpermeabilisierungsmittel⁷angeboten und in mehreren Studien⁷,^8,9,10erfolgreich in Kombination mit einem extrazellulären Flussmittelanalysator eingesetzt . Wir haben ein Protokoll mit rPFO modifiziert, um den mitochondrialen Substratfluss mit dem extrazellulären Flussanalysator XFe96 zu screenen. In diesem Protokoll werden vier verschiedene Substratoxidationswege in zwei zellulären Phänotypen verglichen, während ausreichende Replikate und die richtige Kontrolle für jedes getestete Material vorhanden sind.

Protocol

1. Einen Tag vor dem Assay Herstellung von Reagenzien und Substraten. Mitochondriale Assay-Lösung (MAS): Herstellung von Stammlösungen aller Reagenzien wie in Tabelle 1beschrieben. Erwärmen Sie die Bestände an Mannitol und Saccharose auf 37 °C, um sich vollständig aufzulösen. Mischen Sie die Reagenzien, um 2x MAS vorzubereiten, dann erwärmen Sie die Mischung auf 37 ° C. Stellen Sie den pH-Wert mit 5N KOH auf 7,4 (~ 7 ml) ein, fügen Sie dann Wasser hinzu, um das Volumen auf 1 …

Representative Results

Beginnen Sie mit der Normalisierung der Ergebnisse auf die zweite Messung der Baseline-Atmung, um Werte als Prozentsatz der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) anzuzeigen. Die Ergebnisse des Assays sind in abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7 und Abbildung 8 dargestellt. Es ist wichtig, jeder Gruppe die richtigen Hintergrundbohrungen zuzuweisen und die Hintergrundbohrungen…

Discussion

Dieses Protokoll ist eine Modifikation der zuvor veröffentlichten Studien^7,8,9,10 und des Produkt-Benutzerhandbuchs. Im Gegensatz zum Protokoll des Herstellers wird anstelle von 3x MAS 2x MAS verwendet, da 2× MAS leichter aufzulösen ist und nach dem Einfrieren keine Ausfällungen bildet. Gefrorene 2x MAS Aliquots können bis zu sechs Monate gelagert werden und zeigen konsistente Ergebnisse. …

Materials

Adinosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate	Merck	A5285	store at -20 °C
Antimycin A	Merck	A8674	store at -20 °C
Bovine serum albumin	Merck	A3803	store at 2 – 8 °C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Merck	C2920	store at -20 °C
Dimethyl sulfoxide	Merck	D8418	store at RT
D-Mannitol	Merck	63559	store at RT
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco	14190-144	store at RT
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid	Merck	03777	store at RT
HEPES	Merck	H7523	store at RT
L(-)Malic acid disodium salt	Merck	M9138	store at RT
L-Glutamic acid sodium salt hydrate	Merck	G5889	store at RT
Magnissium chloride hexahydrate	Merck	M2670	store at RT
Oligomycin	Merck	O4876	store at -20 °C
Palmitoyl-DL-carnitine chloride	Merck	P4509	store at -20 °C
Potassium hydroxide	Merck	484016	store at RT
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655	store at RT
Rotenone	Merck	R8875	store at -20 °C
Seahorse Wave Desktop Software	Agilent technologies		Download from www.agilent.com
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent technologies
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent technologies	102416-100	XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates
Sodium pyruvate	Merck	P2256	store at 2 – 8 °C
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Merck	S2378	store at RT
Sucrose	Merck	S7903	store at RT
Water	Merck	W3500	store at RT
XF calibrant	Agilent technologies	100840-000	store at RT
XF Plasma membrane permeabilizer	Agilent technologies	102504-100	Recombinant perfringolysin O (rPFO) – Aliquot and store at -20 °C