测量重组透气溶性细胞中线粒体底物通量 O-透化细胞
Summary
在这项工作中，我们描述了一种改进的方案，以使用重组产气溶酶O与基于微孔板的呼吸测定法一起测试线粒体呼吸底物通量。通过该协议，我们展示了二甲双胍如何影响两种不同肿瘤细胞系的线粒体呼吸。
Abstract
线粒体底物通量是每种细胞类型的显着特征，其成分（如转运蛋白，通道或酶）的变化与几种疾病的发病机制有关。线粒体底物通量可以使用完整细胞、透化细胞或分离的线粒体进行研究。研究完整的细胞由于同时氧化不同的底物而遇到几个问题。此外，几种细胞类型包含不同底物的内部存储，使结果解释复杂化。线粒体分离或使用透化剂等方法不易重复。从小样品中分离出具有完整膜的纯线粒体是有问题的。使用非选择性透化剂会导致不同程度的不可避免的线粒体膜损伤。重组透气溶酶O（rPFO）作为更合适的透气剂提供，因为它能够选择性地透化质膜而不影响线粒体完整性。当与微孔板呼吸法结合使用时，它允许在一个实验中使用最少数量的细胞，在一个实验中用足够的重复来测试几种线粒体底物的通量。在这项工作中，该协议描述了一种比较两种不同细胞表型或基因型的线粒体底物通量的方法，并且可以定制以测试各种线粒体底物或抑制剂。
Introduction
基于微孔板的呼吸测定法通过能够研究小样本量1的细胞呼吸，彻底改变了线粒体研究。细胞呼吸通常被认为是线粒体功能或”功能障碍”的指标，尽管线粒体功能范围超出了能量产生2。在有氧条件下，线粒体通过分解并将这些底物转化为可以为柠檬酸循环3 提供燃料的代谢中间体来提取储存在不同底物中的能量（图1）。底物的连续通量对于柠檬酸循环的流动至关重要，以产生高能”电子供体”，其将电子传递到电子传递链，该传递链产生穿过线粒体内膜的质子梯度，使ATP合成酶能够将ADP磷酸化为ATP4。因此，测定线粒体呼吸的实验设计必须包括样品性质（完整细胞，透化细胞或分离的线粒体）和线粒体底物。
细胞储存着本土底物5，线粒体同时氧化几种类型的底物6，这使得对在完整细胞上进行实验的结果的解释变得复杂。研究线粒体氧化所选底物能力的常用方法是分离线粒体或透化所研究的细胞5。虽然分离的线粒体是定量研究的理想选择，但分离过程很费力。它面临着技术难题，例如需要大样本量，纯度产量和该技术的再现性5。透化细胞为线粒体分离的缺点提供了解决方案;然而，洗涤剂性质的常规通透性剂不是特异性的，并且可能损害线粒体膜5。
重组鼓气溶酶O（rPFO）作为选择性质膜透化剂7提供，并在7，8，9，10的几项研究中成功地与细胞外通量分析仪结合使用。我们使用rPFO修改了使用XFe96细胞外通量分析仪筛选线粒体底物通量的方案。在该协议中，比较了两种细胞表型中的四种不同的底物氧化途径，同时对每种测试材料具有足够的重复和适当的控制。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议是对先前发表的研究7、8、9、10和产品用户指南的修改。与制造商的协议相比，使用2x MAS代替3x MAS，因为2× MAS更容易溶解，并且在冷冻后不会形成沉淀。冷冻的 2 倍 MAS 等分试样可储存长达 6 个月，并显示一致的结果。另一个区别是将ADP包含在2x MAS的组分中，并从公式中省略BSA。含有BSA的解决?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢Hradec Králové医学院生理学系和第三医学院病理生理学系的工作人员在化学品和样品制备方面的帮助。这项工作得到了查理大学拨款计划PROGRES Q40/02，捷克卫生部拨款NU21-01-00259，捷克科学基金会拨款18-10144和INOMED项目CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046的支持，该项目由捷克共和国教育，青年和体育部和欧盟资助。
Materials
| Adinosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 – 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnissium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 – 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) – Aliquot and store at -20 °C |
References
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