Mesure du flux de substrat mitochondrial dans les cellules O-perméabilisées de perfringolysine recombinante

Moustafa Elkalaf; Karolína Vaněčková; Pavla Staňková; Zuzana Červinková; Jan Polák; Otto Kučera

doi:10.3791/62902

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Article de méthode

Mesure du flux de substrat mitochondrial dans les cellules O-perméabilisées de perfringolysine recombinante

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DOI :

10.3791/62902

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13 août 2021

Moustafa Elkalaf¹^,² , Karolína Vaněčková¹^,² , Pavla Staňková¹ , Zuzana Červinková¹ , Jan Polák^*²^,³ , Otto Kučera^*¹

¹Department of Physiology, Faculty of Medicine in Hradec Králové, Charles University, ²Department of Pathophysiology, Third Faculty of Medicine, Charles University, ³Department of Internal Medicine, University Hospital Kralovske Vinohrady

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Dans ce travail, nous décrivons un protocole modifié pour tester le flux de substrat respiratoire mitochondrial en utilisant la perfringolysine O recombinante en combinaison avec la respirométrie à base de microplaques. Avec ce protocole, nous montrons comment la metformine affecte la respiration mitochondriale de deux lignées cellulaires tumorales différentes.

Résumé

Le flux de substrat mitochondrial est une caractéristique distinctive de chaque type de cellule, et des changements dans ses composants tels que les transporteurs, les canaux ou les enzymes sont impliqués dans la pathogenèse de plusieurs maladies. Le flux de substrat mitochondrial peut être étudié à l’aide de cellules intactes, de cellules perméabilisées ou de mitochondries isolées. L’étude de cellules intactes rencontre plusieurs problèmes dus à l’oxydation simultanée de différents substrats. En outre, plusieurs types de cellules contiennent des réserves internes de différents substrats qui compliquent l’interprétation des résultats. Les méthodes telles que l’isolement mitochondrial ou l’utilisation d’agents perméabilisants ne sont pas facilement reproductibles. Isoler des mitochondries pures avec des membranes intactes en quantité suffisante à partir de petits échantillons est problématique. L’utilisation de perméabilisateurs non sélectifs provoque divers degrés de dommages inévitables à la membrane mitochondriale. La perfringolysine O recombinante (FPSR) a été proposée comme perméabilisant plus approprié, grâce à sa capacité à perméabiliser sélectivement la membrane plasmique sans affecter l’intégrité mitochondriale. Lorsqu’il est utilisé en combinaison avec la microflamétrie, il permet de tester le flux de plusieurs substrats mitochondriaux avec suffisamment de répliques dans une expérience tout en utilisant un nombre minimal de cellules. Dans ce travail, le protocole décrit une méthode pour comparer le flux de substrat mitochondrial de deux phénotypes ou génotypes cellulaires différents et peut être personnalisé pour tester divers substrats ou inhibiteurs mitochondriaux.

Introduction

La respirométrie à base de microplaques a révolutionné la recherche mitochondriale en permettant l’étude de la respiration cellulaire d’un échantillon de petite taille^1. La respiration cellulaire est généralement considérée comme un indicateur de la fonction mitochondriale ou du « dysfonctionnement », malgré le fait que la gamme mitochondriale des fonctions s’étend au-delà de la production d’énergie². Dans des conditions aérobies, les mitochondries extraient l’énergie stockée dans différents substrats en décomposant et en convertissant ces substrats en intermédiaires métaboliques pouvant alimenter le cycle de l’acide cit....