पुनः संयोजक Perfringolysin O-Permeabilized कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट फ्लक्स को मापना
Summary
इस काम में, हम माइक्रोप्लेट-आधारित रेस्पिरोमेट्री के साथ संयोजन में पुनः संयोजक perfringolysin O का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन सब्सट्रेट फ्लक्स का परीक्षण करने के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल के साथ, हम दिखाते हैं कि मेटफॉर्मिन दो अलग-अलग ट्यूमर सेल लाइनों के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को कैसे प्रभावित करता है।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट फ्लक्स प्रत्येक सेल प्रकार की एक विशिष्ट विशेषता है, और इसके घटकों जैसे ट्रांसपोर्टर, चैनल, या एंजाइमों में परिवर्तन कई बीमारियों के रोगजनन में शामिल हैं। माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट फ्लक्स का अध्ययन बरकरार कोशिकाओं, permeabilized कोशिकाओं, या पृथक माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग करके किया जा सकता है। अक्षुण्ण कोशिकाओं की जांच विभिन्न सब्सट्रेट्स के एक साथ ऑक्सीकरण के कारण कई समस्याओं का सामना करती है। इसके अलावा, कई सेल प्रकारों में विभिन्न सब्सट्रेट्स के आंतरिक भंडार होते हैं जो परिणामों की व्याख्या को जटिल बनाते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव या permeabilizing एजेंटों का उपयोग करने जैसे तरीके आसानी से पुन: प्रस्तुत करने योग्य नहीं हैं। छोटे नमूनों से पर्याप्त मात्रा में बरकरार झिल्ली के साथ शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करना समस्याग्रस्त है। गैर-चयनात्मक permeabilizers का उपयोग अपरिहार्य माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षति के विभिन्न डिग्री का कारण बनता है। पुनः संयोजक perfringolysin O (rPFO) को एक अधिक उपयुक्त permeabilizer के रूप में पेश किया गया था, माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता को प्रभावित किए बिना चुनिंदा रूप से प्लाज्मा झिल्ली को permeabilize करने की क्षमता के लिए धन्यवाद। जब माइक्रोप्लेट श्वसनमिति के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, तो यह कोशिकाओं की न्यूनतम संख्या का उपयोग करते हुए एक प्रयोग के भीतर पर्याप्त प्रतिकृति के साथ कई माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट के प्रवाह का परीक्षण करने की अनुमति देता है। इस काम में, प्रोटोकॉल दो अलग-अलग सेलुलर फेनोटाइप या जीनोटाइप के माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट फ्लक्स की तुलना करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है और विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट या अवरोधकों का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
माइक्रोप्लेट-आधारित श्वसनमिति ने एक छोटे से नमूना आकार1के सेलुलर श्वसन के अध्ययन को सक्षम करके माइटोकॉन्ड्रियल अनुसंधान में क्रांति ला दी है। सेलुलर श्वसन को आम तौर पर माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन या ‘डिसफंक्शन’ के संकेतक के रूप में माना जाता है, इस तथ्य के बावजूद कि कार्यों की माइटोकॉन्ड्रियल रेंज ऊर्जा उत्पादन से परे फैली हुईहै। एरोबिक स्थितियों में, माइटोकॉन्ड्रिया विभिन्न सब्सट्रेट्स में संग्रहीत ऊर्जा को तोड़कर और इन सब्सट्रेट्स को चयापचय मध्यवर्ती में परिवर्तित करके निकालता है जो साइट्रिक एसिड चक्र3 (चित्रा 1)को ईंधन दे सकता है। सब्सट्रेट्स का निरंतर प्रवाह साइट्रिक एसिड चक्र के प्रवाह के लिए उच्च ऊर्जा ‘इलेक्ट्रॉन दाताओं’ को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है, जो इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में इलेक्ट्रॉनों को वितरित करता है जो आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में एक प्रोटॉन ढाल उत्पन्न करता है, एटीपी-सिंथेज़ को एटीपी4के लिए फॉस्फोराइलेट एडीपी को सक्षम करता है। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन परख करने के लिए एक प्रयोगात्मक डिजाइन में नमूना प्रकृति (बरकरार कोशिकाओं, permeabilized कोशिकाओं, या पृथक माइटोकॉन्ड्रिया) और माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट शामिल होना चाहिए।
कोशिकाएं स्वदेशीसब्सट्रेट्स 5का एक स्टोर रखती हैं, और माइटोकॉन्ड्रिया कई प्रकार के सब्सट्रेट्स को एक साथ6ऑक्सीकरण करते हैं, जो बरकरार कोशिकाओं पर किए गए प्रयोगों से प्राप्त परिणामों की व्याख्या को जटिल बनाता है। एक चयनित सब्सट्रेट को ऑक्सीकरण करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता की जांच करने के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करना या जांच की गई कोशिकाओं को परमेबिलाइज़ करनाहै। यद्यपि पृथक माइटोकॉन्ड्रिया मात्रात्मक अध्ययन के लिए आदर्श हैं, अलगाव प्रक्रिया श्रमसाध्य है। यह तकनीकी कठिनाइयों का सामना करता है जैसे कि बड़े नमूना आकार की आवश्यकता, उपज की शुद्धता, और तकनीक की पुनरुत्पादकता5। Permeabilized कोशिकाएं माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव के नुकसान के लिए एक समाधान प्रदान करती हैं; हालांकि, डिटर्जेंट प्रकृति के नियमित permeabilizing एजेंट विशिष्ट नहीं हैं और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को नुकसान पहुंचा सकते हैं5।
पुनः संयोजक perfringolysin O (rPFO) एक चयनात्मक प्लाज्मा झिल्ली permeabilizing एजेंट 7 के रूप में की पेशकश की गई थी, और यह सफलतापूर्वककईअध्ययनों 7,8,9,10में एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया था। हमने XFe96 एक्स्ट्रासेल्युलर फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट फ्लक्स को स्क्रीन करने के लिए आरपीएफओ का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल को संशोधित किया है। इस प्रोटोकॉल में, दो सेलुलर फेनोटाइप में चार अलग-अलग सब्सट्रेट ऑक्सीकरण मार्गों की तुलना की जाती है, जबकि प्रत्येक परीक्षण की गई सामग्री के लिए पर्याप्त प्रतिकृति और उचित नियंत्रण होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित अध्ययन7,8,9,10 और उत्पाद उपयोगकर्ता गाइड का एक संशोधन है। निर्माता के प्रोटोकॉल के विपरीत, 3x MAS के बजाय 2x MAS का उपयोग किया जाता है, क्…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों Hradec Králové में चिकित्सा के संकाय में फिजियोलॉजी विभाग के कर्मचारियों के सदस्यों और रसायनों और नमूनों की तैयारी के साथ मदद के लिए चिकित्सा के तीसरे संकाय में Pathophysiology विभाग के सदस्यों को धन्यवाद. इस काम को चार्ल्स विश्वविद्यालय अनुदान कार्यक्रमों PROGRES Q40/02, चेक स्वास्थ्य मंत्रालय अनुदान NU21-01-00259, चेक विज्ञान फाउंडेशन अनुदान 18-10144 और INOMED परियोजना CZ.02.1.01/0.0/0.0/0.0/18_069/0010046 द्वारा समर्थित किया गया था, जो चेक गणराज्य के शिक्षा, युवा और खेल मंत्रालय और यूरोपीय संघ द्वारा वित्त पोषित है।
Materials
| Adinosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 – 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnissium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 – 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) – Aliquot and store at -20 °C |
References
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