En este trabajo, describimos un protocolo modificado para probar el flujo del sustrato respiratorio mitocondrial utilizando perfringolisina O recombinante en combinación con respirometría basada en microplacas. Con este protocolo, mostramos cómo la metformina afecta la respiración mitocondrial de dos líneas celulares tumorales diferentes.
El flujo de sustrato mitocondrial es una característica distintiva de cada tipo de célula, y los cambios en sus componentes, como transportadores, canales o enzimas, están involucrados en la patogénesis de varias enfermedades. El flujo de sustrato mitocondrial se puede estudiar utilizando células intactas, células permeabilizadas o mitocondrias aisladas. La investigación de células intactas encuentra varios problemas debido a la oxidación simultánea de diferentes sustratos. Además, varios tipos de células contienen almacenes internos de diferentes sustratos que complican la interpretación de los resultados. Métodos como el aislamiento mitocondrial o el uso de agentes permeabilizantes no son fácilmente reproducibles. Aislar mitocondrias puras con membranas intactas en cantidades suficientes a partir de muestras pequeñas es problemático. El uso de permeabilizadores no selectivos causa varios grados de daño inevitable de la membrana mitocondrial. La perfringolisina O recombinante (rPFO) se ofreció como un permeabilizante más apropiado, gracias a su capacidad para permeabilizar selectivamente la membrana plasmática sin afectar la integridad mitocondrial. Cuando se usa en combinación con la respirometría de microplacas, permite probar el flujo de varios sustratos mitocondriales con suficientes réplicas dentro de un experimento mientras se usa un número mínimo de células. En este trabajo, el protocolo describe un método para comparar el flujo de sustrato mitocondrial de dos fenotipos o genotipos celulares diferentes y se puede personalizar para probar varios sustratos o inhibidores mitocondriales.
La respirometría basada en microplacas ha revolucionado la investigación mitocondrial al permitir el estudio de la respiración celular de un tamaño de muestra pequeño1. La respiración celular generalmente se considera como un indicador de la función mitocondrial o “disfunción”, a pesar del hecho de que el rango mitocondrial de funciones se extiende más allá de la producción de energía2. En condiciones aeróbicas, las mitocondrias extraen la energía almacenada en diferentes sustratos descomponiendo y convirtiendo estos sustratos en intermedios metabólicos que pueden alimentar el ciclo del ácido cítrico3 (Figura 1). El flujo continuo de sustratos es esencial para que el flujo del ciclo del ácido cítrico genere ‘donantes de electrones’ de alta energía, que entregan electrones a la cadena de transporte de electrones que genera un gradiente de protones a través de la membrana mitocondrial interna, lo que permite que la ATP-sintasa fosforila ADP a ATP4. Por lo tanto, un diseño experimental para evaluar la respiración mitocondrial debe incluir la naturaleza de la muestra (células intactas, células permeabilizadas o mitocondrias aisladas) y sustratos mitocondriales.
Las células mantienen un almacén de sustratos autóctonos5,y las mitocondrias oxidan varios tipos de sustratos simultáneamente6,lo que complica la interpretación de los resultados obtenidos de los experimentos realizados sobre células intactas. Un enfoque común para investigar la capacidad mitocondrial para oxidar un sustrato seleccionado es aislar las mitocondrias o permeabilizar las células investigadas5. Aunque las mitocondrias aisladas son ideales para estudios cuantitativos, el proceso de aislamiento es laborioso. Se enfrenta a dificultades técnicas como la necesidad de un gran tamaño de muestra, la pureza del rendimiento y la reproducibilidad de la técnica5. Las células permeabilizadas ofrecen una solución para las desventajas del aislamiento mitocondrial; sin embargo, los agentes permeabilizantes rutinarios de naturaleza detergente no son específicos y pueden dañar las membranas mitocondriales5.
La perfringolisina O recombinante (rPFO) se ofreció como agente permeabilizante selectivo de la membrana plasmática7,y se utilizó con éxito en combinación con un analizador de flujo extracelular en varios estudios7,8,9,10. Hemos modificado un protocolo utilizando rPFO para detectar el flujo de sustrato mitocondrial utilizando el analizador de flujo extracelular XFe96. En este protocolo, se comparan cuatro vías oxidantes de sustrato diferentes en dos fenotipos celulares mientras se tienen suficientes réplicas y el control adecuado para cada material probado.
Este protocolo es una modificación de los estudios publicados previamente7,8,9,10 y la guía del usuario del producto. En contraste con el protocolo del fabricante, se utiliza 2x MAS en lugar de 3x MAS, ya que 2× MAS es más fácil de disolver y no forma precipitaciones después de la congelación. Las alícuotas MAS congeladas 2x se pueden almacenar hasta seis meses y muestran resultados con…
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a los miembros del personal del Departamento de Fisiología de la Facultad de Medicina de Hradec Králové y del Departamento de Fisiopatología de la Tercera Facultad de Medicina por la ayuda con los productos químicos y la preparación de muestras. Este trabajo fue apoyado por los programas de subvenciones de la Universidad Charles PROGRES Q40/02, la subvención NU21-01-00259 del Ministerio de Salud de la República Checa, la subvención de la fundación científica checa 18-10144 y el proyecto INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 financiado por el Ministerio de Educación, Juventud y Deportes de la República Checa y por la Unión Europea.
Adinosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 – 8 °C |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
Magnissium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 – 8 °C |
Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
Water | Merck | W3500 | store at RT |
XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) – Aliquot and store at -20 °C |