Summary
Primære microglia-kulturer bruges almindeligvis til at evaluere nye antiinflammatoriske molekyler. Den nuværende protokol beskriver en reproducerbar og relevant metode til magnetisk isolering af microglia fra nyfødte hvalpe.
Abstract
Microglia, som hjerneboende makrofager, er grundlæggende for flere funktioner, herunder respons på miljøstress og hjernehomeostase. Microglia kan vedtage et stort spektrum af aktiveringsfænotyper. Desuden er microglia, der støtter proinflammatorisk fænotype, forbundet med både neuroudviklingsmæssige og neurodegenerative lidelser. In vitro-undersøgelser anvendes i vid udstrækning i forskning til at evaluere potentielle terapeutiske strategier i specifikke celletyper. I denne sammenhæng er det mere relevant at studere mikroglial aktivering og neuroinflammation in vitro ved hjælp af primære mikroglialkulturer end mikroglialcellelinjer eller stamcelleafledt microglia. Imidlertid kan brugen af nogle primære kulturer lide af manglende reproducerbarhed. Denne protokol foreslår en reproducerbar og relevant metode til magnetisk isolering af microglia fra nyfødte hvalpe. Mikroglial aktivering ved hjælp af flere stimuli efter 4 timer og 24 timer ved mRNA-ekspressionskvantificering og et Cy3-perle fagocytisk assay er demonstreret her. Det nuværende arbejde forventes at give en let reproducerbar teknik til isolering af fysiologisk relevant mikroglia fra ungdomsudviklingsstadier.
Introduction
Microglia er centralnervesystemet bosiddende makrofaglignende celler afledt af erythropoietiske forstadier af æggeblommesækken, der migrerer til neuroepitelet under tidlig embryonal udvikling1. Bortset fra deres immunitetsfunktioner spiller de også en væsentlig rolle under neuroudvikling, især for synaptogenese, neuronal homeostase og myelinering2. I voksenalderen udvikler microglia lange cellulære processer til at scanne miljøet kontinuerligt. I tilfælde af homeostasebrud som hjerneskade eller hjernesygdom kan microglia ændre deres morfologiske udseende for at vedtage en amoeboid form, migrere til det skadede område, øge og frigive mange cytoprotektive eller cytotoksiske faktorer. Microglia har heterogene aktiveringstilstande afhængigt af deres udviklingsstadium og typen af skade, der er pådraget 3,4,5. I denne undersøgelse er disse aktiveringstilstande bredt klassificeret i tre forskellige fænotyper: proinflammatorisk / fagocytisk, antiinflammatorisk og immunoregulerende, idet man husker på, at situationen i virkeligheden sandsynligvis vil være mere kompleks6.
At studere in vivo mikroglial aktivering og screening for neurobeskyttende strategier i tidlige stadier af hjernens udvikling kan være udfordrende på grund af (1) skrøbelighed hos dyr før fravænning og (2) det lave antal mikroglialceller. Derfor anvendes in vitro-undersøgelser af microglia i vid udstrækning for toksicitet 7,8,9, neurobeskyttende strategier5,10,11,12,13,14 og cokulturer 15,16,17,18,19,20,21 . In vitro-undersøgelser kan anvende enten mikroglialcellelinjer, stamcelleafledt microglia eller primær microglia-kultur. Alle disse tilgange har fordele og ulemper, og valget afhænger af det oprindelige biologiske spørgsmål. Fordelene ved at bruge primære microglia-kulturer er den homogene genetiske baggrund, patogenfri historie og kontrol af det tidspunkt, hvor microglia stimuleres efter dyredød22.
I årenes løb blev der udviklet forskellige metoder (flowcytometri, rystelser eller magnetisk mærkning) til dyrkning af primær mikroglia fra gnavere, både nyfødte og voksne 23,24,25,26,27,28,29. I det foreliggende arbejde udføres mikroglia-isolering fra musenyfødte hvalpe ved hjælp af tidligere beskrevet magnetisk aktiveret cellesorteringsteknologi ved hjælp af mikroperlebelagt anti-mus CD11b25,27,29. CD11b er en integrinreceptor udtrykt på overfladen af myeloide celler, herunder microglia. Når der ikke er nogen inflammatorisk udfordring i hjernen, er næsten alle CD11b + celler microglia30. Sammenlignet med andre tidligere offentliggjorte metoder 23,24,25,26,27,28,29 balancerer den nuværende protokol øjeblikkelige ex vivo mikroglialaktiveringsanalyser og almindelig in vitro primær mikroglialkultur. Således isoleres microglia (1) ved postnatal dag (P)8 uden myelinfjernelse, (2) dyrkes uden serum og (3) udsættes enten for siRNA, miRNA, farmakologisk forbindelse og / eller inflammatoriske stimuli kun 48 timer efter hjerneisolering. Hvert af disse tre aspekter gør den nuværende protokol relevant og hurtig. Først og fremmest tillader brugen af pædiatrisk microglia at opnå dynamiske og reaktive levedygtige celler i kultur uden at kræve et yderligere demyeliniseringstrin, der potentielt kan ændre mikroglial reaktivitet in vitro. Den nuværende protokol sigter mod at komme så tæt som muligt på det fysiologiske miljø i microglia. Faktisk støder microglia aldrig på serum, og denne protokol kræver heller ikke brug af serum. Desuden forhindrer eksponering af microglia så tidligt som 48 timer efter kultur dem i at miste deres fysiologiske evner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen blev godkendt, og alle dyrene blev håndteret i henhold til de institutionelle retningslinjer fra Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Frankrig). Magnetisk isolering af microglia fra hjernen hos 24 OF1 museunger (både mandlige og kvindelige) ved P8, opdelt i 6-brønd, 12-brønd eller 96-brøndplader, præsenteres. Det eksperimentelle arbejde blev udført under en hætte for at opretholde sterile forhold.
1. Fremstilling af sterile opløsninger til isolering og cellekultur
- Forbered 50 ml 1x Hanks' afbalancerede saltopløsning (HBSS) uden Ca 2+ og Mg2+ (HBSS-/-) fra den kommercielt tilgængelige 10x-opløsning (se materialetabel).
- Der fremstilles dissociationsblanding i henhold til sammensætningen i tabel 1 ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt vævsdissociationssæt (se Materialetabel).
- Forbered 200 ml 1x HBSS med Ca 2+ og Mg2+ (HBSS+/+) fra den kommercielt tilgængelige 10x opløsning.
- Forbered 200 ml 1x PBS + 0,5% BSA (kaldet cellesorteringsbuffer).
- Der fremstilles CD11b-mikroperler i henhold til tabel 2.
- Forbered 500 ml makrofagserumfrit kulturmedium (SFM) + 1% penicillin-streptomycin (P / S). Lav alikvoter af 50 ml rør og opbevar dem ved 4 °C. Dette kaldes microglia-mediet senere i teksten.
BEMÆRK: Alle isoleringsopløsninger skal være frisklavede under sterile forhold på forsøgsdagen og opbevares på is. Microglia-cellekulturmedium kan fremstilles, aliciteres i 50 ml rør og opbevares ved 4 °C til fremtidig brug. Filtrering er ikke nødvendig.
2. Hjerne dissektion
- Afhug hvalpens hoved ved hjælp af en stor saks uden tidligere generel anæstesi.
- Skær huden fra halsen til næsen efter sagittal suturen (15-20 mm) med en lille saks (figur 1A-C).
- Indsæt en lille saksspidser i Foramen magnum parallelt med kraniet. Skær forsigtigt fra hver side til øjnene (figur 1D, E).
- Klip mellem øjnene med en lille saks for at løsne kraniet og hjernen fra hovedet (figur 1F).
- Med to tang skal du gribe kraniet tæt på de olfaktoriske pærer og rive kraniet forsigtigt og passe på ikke at beskadige den underliggende hjerne (figur 1G-I).
- Fjern lillehjernen og olfactive pære med et barberblad og skær hjernen i to stykker (figur 1J).
- Hjernestykkerne anbringes i en petriskål indeholdende 30-40 ml HBSS-/- (figur 1K).
3. Hjernedissociation og magnetisk mikroglial isolation
BEMÆRK: Alle cellemanipulationer og resuspensioner skal udføres med en 1.000 μL pipette med stor forsigtighed. Anvendelse af en høj mekanisk virkning kan aktivere eller dræbe microglia-celler.
- Overfør 12 hjernestykker (~ 1,2 g) pr. dissociationsrør indeholdende dissociationsblanding i henhold til tabel 1. For 24 hvalpe var der brug for fire C-rør (figur 2A-B).
- Placer C-rør på dissociatoren (med opvarmningstilstand). Start det optimerede NTDK-program i udstyret i henhold til producentens instruktion (figur 2D).
- Der centrifugeres ved 300 x g i 20 s (ved 4 °C) for at opsamle alle cellerne. Den mekaniske dissociation fuldføres ved at pipettere tre gange op og ned med en pipette på 1.000 μL (figur 2E).
- Overfør cellerne til fire 15 ml rør + sil. Skyl sierne med 10 ml HBSS+/+ (figur 2F).
- Der centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter (ved 4 °C), og supernatanten fjernes. Pelleten genoptages forsigtigt med 10 ml HBSS+/+ (figur 2G).
- Der centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter (ved 4 °C), og supernatanten fjernes. Pelleten gensuspenderes forsigtigt med 6 ml sorteringsbuffer (trin 1.4) (figur 2H).
- Der centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter (ved 4 °C), og supernatanten fjernes. Der tilsættes 200 μL CD11b-mikroperleopløsning (trin 1.5) pr. rør og resuspenderes forsigtigt (figur 2I).
- Rørene inkuberes i 15-20 minutter ved 4 °C. Pelleten gensuspenderes forsigtigt med 6 ml sorteringsbuffer (figur 2I-J).
- Der centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter (ved 4 °C), og supernatanten fjernes. Pelleten gensuspenderes forsigtigt med 8 ml sorteringsbuffer (figur 2K).
- Følg POSSEL-programmet på separatoren (se Materialetabel) for at forberede otte kolonner. Overfør celler 1 ml med 1 ml på kolonnen. Vent på, at alle cellerne passerer igennem, før du tilføjer en anden ml. Elute CD11b+ celler på steril elueringsplade med 1 ml sorteringsbuffer (figur 2L).
- Saml CD11b+ celler i et nyt 50 ml rør (figur 2M).
- Der centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter (ved 4 °C), og supernatanten fjernes. Pelleten gensuspenderes forsigtigt med 10 ml koldt mikrogliamedium (trin 1.6) (figur 2N).
- Tæl CD11b+ cellerne. På P8 skal man få ~650.000 celler pr. hjerne.
BEMÆRK: I den nuværende protokol blev cellerne talt ved hjælp af en automatiseret celletæller (se Materialetabel). - Resuspender cellerne i koldt mikrogliamedium til en endelig koncentration på 650.000-700.000 celler / ml og dispenser i cellekulturplader.
BEMÆRK: De 6-brønds plader er til Western Blot (2 ml pr. Brønd); 12-brøndspladerne er til RT-qPCR-analyse (1 ml pr. Brønd), og pladerne med 96 brønde er til fagocytisk assay (250 μL pr. Brønd); alle tre blev brugt til dette arbejde. I dette manuskript vises resultaterne fra Western Blot-analysen imidlertid ikke, men det er muligt at udføre med denne protokol. - Pladerne anbringes ved 37 °C med 5 % CO2 natten over. Mediet skiftes forsigtigt med en 1.000 μL pipette med forvarmet mikrogliamedium.
- Pladerne anbringes ved 37 °C med 5 % CO2 natten over før stimulering.
BEMÆRK: Isolering af microglia fra mere end 36 hvalpe og efter P9 anbefales ikke. Dette vil øge risikoen for forurening og ophobning af celleaffald for at aktivere microglia.
4. Cellestimuleringer
- Der fremstilles stimuleringsreagenser i henhold til tabel 3 ved hjælp af de kommercielt tilgængelige reagenser (se materialetabel).
- Tilsæt det passende volumen i hver stimuleret brønd.
BEMÆRK: Det passende volumen afhænger af koncentrationen af stimulus og brøndens størrelse. - Pladerne anbringes ved 37 °C med 5 % CO2indtil stimuleringens afslutning ved 6 timer, 24 timer eller 48 timer.
- Til Western Blot-analysen aspireres supernatanten og tilsættes 50 μL proteinlysebuffer (se Materialetabel) med en pipette. Brug tip til at ridse bunden af pladen for at løsne de lyserede celler og overføre dem til 1,5 ml rør. Opbevares ved -80 °C.
BEMÆRK: Kulturpladerne kan opbevares i årevis ved -80 °C, hvis supernatanten er aspireret korrekt. - Til RT-qPCR-analyse 6,31 opsuges supernatanten, og dyrkningspladerne opbevares direkte ved -80 °C indtil mRNA-ekstraktion (trin 5).
- For det fagocytiske assay, se trin 6.
5. mRNA-ekstraktion og RT-qPCR-analyse
- Udfør RNA-ekstraktion, RT-PCR og RT-qPCR efter producentens protokol (se Materialetabel). Der henvises til tabel 4 for primersekvenserne 5,6,31.
- Udfør RT-qPCR-analyse ved at følge den tidligere offentliggjorte rapport5.
6. Fagocytisk analyse
- Stimulere cellerne og udføre fagocytisk assay i løbet af de sidste 3 timer af stimuleringen. For eksempel til stimulering af 6 timer skal du starte det fagocytiske assay efter 3 timers stimulering; og til stimulering af 12 timer, start det fagocytiske assay 9 timer efter stimuleringens begyndelse.
- Beregn antallet af perler, der er nødvendige for at forberede i betragtning af forholdet (1 celle: 50 perler). For en brønd af 96-brøndpladen kræves 8,1 x 106 perler. Forbered perleblandingen i henhold til tabel 5.
BEMÆRK: Væld forsigtigt hætteglasset med perlebestanden, inden det tilsættes PBS/FBS-blandingen. - Der inkuberes i 1 time i et vandbad ved 37 °C. Vortex hvert 10. minut.
- Beregn opløsningsvolumenet, der skal føjes til hvert hul. Tilsæt opløsningen og inkuber i 3 timer.
- Skyl brøndene tre gange med 1x PBS. Aflæs fluorescensemissionen ved 550 nm (Cy3-emissionsbølgelængde).
7. Renhed kvalitetskontrol
- Evaluer renheden af CD11b magnetisk isolering ved flowcytometri (FACS) (før og efter cellesortering), og udfør derefter RT-qPCR.
- Cellerne tælles, og der resuspenderes i FACS-bufferen (PBS + 2 mM EDTA + 0,5 % bovin serumalbumin) for at opnå en fortynding på 10 x 106 celler/ml efter trin 3,5 og trin 3,14.
- Efter 15 minutter af den konventionelle Fc-blokering 32,33 inkuberes cellerne i 15 minutter med levedygtighedssonde (FVS780) og fluorophorekonjugerede antistoffer mod mus CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 eller deres tilsvarende kontrolisotyper 32,33 i den koncentration, som fabrikanterne anbefaler (se Materialetabel).
- Vask cellerne med FACS-buffer, fix og gennemtrængelig med et kommercielt tilgængeligt permeabiliseringssæt (se Materialetabel).
- Udfør Fc-blokering igen på de permeabiliserede celler, og inkuber derefter med fluorophorekonjugeret antistof mod NeuN (se Materialetabel) eller dets kontrolisotype i 15 minutter.
- Udfør FACS-analyse efter vask med FACS-buffer.
- Efter at have ekskluderet dubletterne og de døde celler baseret på henholdsvis morfologiske parametre og FVS780-farvning, skal du vælge gatingstrategien for overfladeekspressionen af CX3CR1 (microglia), ACSA-2 (astrocytter), O4 (oligodendrocytter) og intracellulær tilstedeværelse af NeuN (neuroner) til analyse af procentdelen af positive celler.
- Efter trin 5 ekstraheres mRNA og udfører RT-qPCR for at kvantificere Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin og Gfap mRNA. Normaliser Cq ved hjælp af Rpl13a mRNA som reporter, og udfør et relativt udtryk for Itgam mRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microglia er den CNS-residente makrofag, der aktiveres, når den udsættes for miljømæssige udfordringer (traumer, giftige molekyler, betændelse)4,5,6,34 (figur 3A). In vitro-undersøgelser af microglia anvendes almindeligvis til at evaluere celleautonome mekanismer relateret til disse miljømæssige udfordringer og karakterisere aktiveringstilstand efter farmakologisk eller genetisk manipulation. Her præsenteres en tilgang til at isolere primær mikroglia på ungdomsstadiet ved hjælp af magnetiske koblede perler.
En let aflæsning for mikroglialaktivering in vitro er at kvantificere mRNA-ekspression af flere mikroglialreaktivitetsmarkører forbundet med en proinflammatorisk fænotype (Cd86, Nos2, Ptgs2, Tnf) eller en antiinflammatorisk fænotype (Cd206, Igf1, Arg1, Lgasl3)5,6,31. Disse fænotyper blev beskrevet afhængigt af mRNA-ekspression efter proinflammatorisk (IL-1β, LPS) eller antiinflammatorisk (IL-4 eller IL-10) stimulus. Nogle markører er klassificeret som immunregulerende markører, fordi de opreguleres gennem pro- og antiinflammatorisk stimulering (figur 3A). Denne klassifikation blev tidligere beskrevet af vores team 5,6,31. Efter 48 timer blev isoleret mikroglial stimuleret med pro- og antiinflammatorisk stimulus i 4 timer eller 24 timer. mRNA blev ekstraheret, og RT-qPCR kvantificeret genekspression. Ved 4 timer og 24 timer induceres proinflammatoriske og immunregulerende markører af IL-1β, IL-1β + IFN-γ og LPS 5,6,31. Ved 4 timer inducerer IL-4-stimulering også den immunregulerende markør Il-1rn6. De induceres stærkt ved 4 timer efter IL-4-stimulering vedrørende antiinflammatoriske markører. Interessant nok er Cd206 også væsentligt opreguleret 24 timer efter IL-1β stimulering6 (figur 3B).
For at evaluere den fagocytiske aktivitet af microglia in vitro blev fluorescerende Cy3 PVC-perler anvendt. De blev forbehandlet med føtalt bovin serum (FBS) for at lette deres fagocytose ved microglia. Microglia blev polariseret mod proinflammatorisk fænotype ved stimulering med IL-1β + IFN-γ eller LPS i 3 timer eller 21 timer. Tre timer før stimuleringens afslutning blev Cy3-perler inkuberet med mikroglialceller. Efter skylning med 1x PBS blev fluorescensintensiteten i hver brønd kvantificeret. Kvantificering i forhold til brønde uden perler blev udtrykt, og der blev taget repræsentative billeder (figur 4). Efter 6 timers stimulering begynder microglia kun at fagocyt Cy3-perler under IL-1β + IFN-γ. Efter en 24 timers stimulering er der en stigning i Cy3-fluorescens for begge slags stimulering. Denne stigning i Cy3-fluorescens fremhæver øget fagocytisk aktivitet (figur 4C).
Flowcytometri (FACS) og RT-qPCR blev udført for at evaluere mikroglialkulturens renhed. Forskellige hjernecellulære populationer kan skelnes ved flowcytometri: CX3CR135 for microglia, O4 for oligodendrocytter 36, NeuN for neuroner 37 og ACSA-2 for astrocytter38. Efter dissociation er alle hjerneceller til stede; Efter cellesortering ved hjælp af CD11b-antistof er der imidlertid kun mikroglia og små mængder O4-celler til stede (figur 5A). 48 timer efter primær cellekultur findes kun mikrogliamarkører som evalueret af RT-qPCR (figur 5B).
Figur 1: Trinvis repræsentation, der viser fjernelsen af hjernen fra kraniet. (A-C) Små sakse blev brugt til at skære huden fra halsen til næsen efter sagittal sutur. (D-E) Den lille saks spidser blev indsat i Foramen magnum parallelt med kraniet, og fra hver side til øjnene blev omhyggeligt skåret. (F) Kraniet og hjernen blev løsrevet fra hovedet ved at skære mellem øjnene med en lille saks. (G-I) Kraniet blev grebet tæt på de olfaktive pærer med to tang og revet forsigtigt for ikke at beskadige den underliggende hjerne. (J) Lillehjernen og den olfaktive pære blev fjernet med et barberblad, og hjernen blev skåret i to stykker. (K) Hjernestykkerne blev anbragt i en petriskål indeholdende 30-40 ml HBSS-/-. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk repræsentation af hjernedissociationer og mikroglialcelleisolering. (A-C) Efter P8 musehjernedissektion og fjernelse af olfaktive pærer og lillehjernen blev hjerner først overført til en petriskål med HBSS +/+ og derefter til dissociationsrør indeholdende dissociationsblandingen. C-rørene blev placeret på dissociatoren (med opvarmningstilstand), og NTDK-programmet blev startet (D). (E) Ved programmets afslutning blev rørene centrifugeret ved 300 x g i 20 s ved 4 °C. dissociation blev derefter afsluttet ved at pipettere tre gange op og ned med en 1.000 μL pipette. (F) Celler blev derefter overført til 15 ml rør + sil på 70 μm og skyllet med 10 ml HBSS +/+. (G) Prøverne blev derefter centrifugeret ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C, supernatanten blev fjernet, og pelleten blev resuspenderet med 10 ml HBSS+/+. H) Rørene centrifugeres igen ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C. supernatanten blev fjernet, og derefter blev pelleten resuspenderet i 6 ml sorteringsbuffer. (I) Rør blev centrifugeret ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C, supernatanten blev fjernet, og CD11b-mikroperleopløsningen (200 μL) blev tilsat. Rør blev inkuberet i 15-20 min ved 4 ° C og derefter resuspenderet i 6 ml sorteringsbuffer (J) og centrifugeret ved 300 x g i 10 minutter ved 4 ° C. (K) Supernatanten blev fjernet, og pelleten blev omhyggeligt resuspenderet i 8 ml sorteringsbuffer. (L) Start derefter POSSEL-programmet på separatoren for at forberede kolonner. Celler blev overført 1 ml x 1 ml på søjlen, og CD11b-celler blev elueret på en steril elueringsplade med 1 ml sorteringsbuffer. (M) CD11b-celler blev samlet i et nyt 50 ml rør og centrifugeret ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C, og supernatanten blev fjernet. (N) Pelleten blev omhyggeligt resuspenderet i 10 ml koldt mikrogliamedium i det sidste trin. Cellerne blev talt og fortyndet i mikroglialmediet til en endelig koncentration på 650.000-700.000 celler / ml dispenseret i cellekulturplader. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Mikroglial aktivering efter eksponering for miljømæssige udfordringer. (A) Forenklet skematisk repræsentation af mikroglialaktiveringsspektrum. (B) Relativ kvantificering af mikroglialaktiveringsmarkører efter 4 timer eller 24 timers stimulering. Tovejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligningstest39 (n = 5-15); fejllinjer repræsenterer SEM; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Evaluering af den fagocytiske aktivitet af microglia in vitro. (A) Repræsentative billeder af microglia Cy3-perler (i rødt) fagocytose efter stimulering af 6 timer eller 24 timer. Billederne blev erhvervet ved hjælp af 20x mål for fluorescensmikroskopet. Skala bar = 100 μm. (B) Relativ kvantificering af fluorescens udsender pr. boring. Statistikker blev udført ved hjælp af tovejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligningstest (n = 4-7); fejllinjer repræsenterer SEM; *p < 0,05, ** p < 0,01, ***p < 0,001. (C) Repræsentativt billede af microglia (IBA-1 + celler i grønt) Cy3-perler (i rødt) fagocytose efter 6 timers stimulering. Billederne erhverves ved hjælp af et 40x mål for det konfokale mikroskop. Skala bar = 300 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Evaluering af CD11b magnetisk isolationsrenhed ved flowcytometri før og efter cellesortering. (A) Rapporterer eksempler fra celletælleren før og efter cellesortering, der fremhæver cellekoncentration og levedygtighed. (B) X-aksen repræsenterer cellekoncentration (celle/ml) og levedygtighed (%) efter CD11b-cellesortering. Søjle søjle graf; fejllinjer repræsenterer SEM (n = 16). Fænotypisk og genekspressionsanalyse af cellepopulationsmarkører før og efter CD11b+ cellesortering. Efter dissociation blev CD11b+ celler fra P8-musehjerner magnetisk sorteret. Ekspression af microglia (CX3CR1), oligodendrocytter (O4 eller Olig2 mRNA), neuroner (NeuN eller Synaptophysin mRNA)) og astrocytter (ACSA-2 eller Gfap mRNA) markører blev analyseret før og efter sortering. (C) FACS-analyse af CX3CR1-, O4-, NeuN- og ACSA-2-ekspression. X-aksen repræsenterer procentdelen af levende celler og celletal. (D) Relativ kvantificering af CD11b + celler ekspression af Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin og Gfap mRNA (x-akse repræsenterer relativ mål mRNA ekspression til Itgam mRNA). Søjle søjle graf; fejllinjer repræsenterer SEM (n = 7). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Opløsning | For et C-rør (μL) | Til fire C-rør (μL) |
| Buffer X | 2850 | 11400 |
| Enzym P (Papain) | 75 | 300 |
| Enzym A (DNAse) | 15 | 60 |
| Buffer Y | 30 | 120 |
| Total | 2970 | 11880 |
Tabel 1: Fremstilling af dissociationsblandingen.
| Opløsning | Til et rør (μL) | Til fire rør (μL) |
| CD11b Mikroperler | 20 | 80 |
| Sortering af buffer | 180 | 720 |
| Total | 200 | 800 |
Tabel 2: Fremstilling af CD11b-mikroperleopløsningen.
| Stimulation | Koncentration (ng/ml) |
| IL-1β | 50 |
| IFN-γ | 20 |
| LP'ER | 10 |
| IL-4 | 30 |
| IL-10 | 20 |
Tabel 3: Stimuleringsreagenserne.
| Gener | Protein | Fremad | Omvendt |
| Arg1 | Arginase 1 | GTG AAG AAC CCA CGG TCT GT | GCC AGA GAT GCT TCC AAC TG |
| Cd206 | Klynge af differentiering 206 | CTT CGG GCC TTT GGA ATA AT | TAG AAG AGC CCT TGG GTT GA |
| Cd32 | Klynge af differentiering 32 | CTG GAA GAA GCT GCC AAA AC | CCA ATG CCA AGG GAG ACT AA |
| Cd86 | Klynge af differentiering 86 | GAG CGG GAT AGT AAC GCT GA | GGC TCT CAC TGC CTT CAC TC |
| Gfap | Glial fibrillary surt protein | AAGCCAAGCACGAAGCTAAC | CTCCTGGTAACTGGCCGACT |
| Igf-1 | Insulin som vækstfaktor 1 | TGG ATG CTC TTC AGT TCG TG | GCA ACA CTC ATC CAC AAT GC |
| Il1-rn | Interleukin 1 receptor antagonist | TTG TGC CAA GTC TGG AGA TG | TTC TCA GAG CGG ATG AAG GT |
| Il4-ra | Interleukin 4 receptor antagonist | GGA TAA GCA GAC CCG AAG C | ACT CTG GAG AGA CTT GGT TGG |
| Itgam | Integrin alfa M | CTGGTGCTCTTGGCTCAT | GGCAGCTTCATTCATCATGT |
| Lgals3 | Lectin Glactoside-bindende opløselig 3 | GAT CAC AAT KAT GGG CAC AG | ATT GAA GCG GGG GTT AAA GT |
| Nr. 2 | Nitrogenoxidsyntase 2 | CCC TTC AAT GGT TGG TAC ATG G | ACA TTG ATC TCC GTG ACA GCC |
| Olig2 | Oligodendrocyt transkriptionsfaktor 2 | CAGCGAGCACCTCAAATCTA | GATGGGCGACTAGACACCAG |
| Ptgs2 | Prostaglandin endoperoxidsyntase 2 | TCA TTC ACC AGA CAG ATT GCT | AAG CGT TTG CGG TAC TCA TT |
| Rpl13 | Ribosomalt protein L13a | ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA | GAG TCC GTT GGT CTT GAG GA |
| Socs3 | Suppressor af cytokin 3 | CGT TGA CAG TCT TCC GAC AA | TAT TCT GGG GGC GAG AAG PÅ |
| Sphk1 | Sphingosin kinase 1 | TCC AGA AAC CCC TGT GTA GC | CAG CAG TGT GCA GTT GAT GA |
| Syp | Synaptophysin | ATCTCAGTCCGTCCCGATCCCA | GCTGTCTTCCTGGTGGGTAC |
| Tnf-α | Tumor nekrose faktor α | GCC TCT TCT KAT TCC TGC TT | AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT |
Tabel 4: RT-qPCR-primersekvenser.
| Stimulation | Til 1-brønd | Til n-brønde |
| Cy3 Perler (1 celle: 50 perler) | 8, 100, 000 | X = (8, 100.000) x n |
| 1x PBS | Y =(100+X)/n | 50 |
| FBS | 50 |
Tabel 5: Fremstilling af perleblandingen til fagocytisk assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det nuværende arbejde præsenterer en primær mikroglialcellekultur ved hjælp af magnetisk sorterede CD11b + celler. Ud over den mikrogliale funktionelle evaluering (RT-qPCR og fagocytiske assays) blev mikroglialkulturens renhed også bestemt.
Klassiske microgliacellekulturer genereres almindeligvis fra P1- eller P2-gnavernyfødt hjerne og samkultur med astrocytter i mindst 10 dage. Microglia adskilles derefter mekanisk ved hjælp af en orbital shaker. Metoden til at isolere og dyrke microglia in vitro blev beskrevet første gang i slutningen af 1990'erne fra hjernen hos nyfødte rotter40,41. Siden da har det været meget brugt til at analysere mikrogliale fænotyper såsom aktiveret / hvilende microglia eller proinflammatorisk / antiinflammatorisk mikroglia. Desuden har dette eksperiment været grundlæggende for at definere microglia som neurotoksiske celler, der dyrkes sammen med neuroner. I 2014 beskrev Biber og samarbejdspartnere imidlertid tre væsentlige ulemper ved at studere microglia in vitro ved hjælp af klassiske metoder42. (1) Forsøget anvender nyfødte hjerner hos rotter/mus (P1/P2), og disse celler har ikke gennemgået alle de modningsprocesser, der kan forekomme in vivo. (2) I samkulturmediet anvendes 10 % FBS; Men in vivo støder Microglia aldrig på sådanne komponenter i et "normalt" miljø. (3) Nylige undersøgelser viser, at in vivo-mikroglia fastholdes af flere hæmmende bestanddele, der ikke er til stede i dyrkningen43,44. Desuden beskrev mange undersøgelser (elektrofysiologisk45 og transkriptomisk46,47) ikke-stimuleret primær mikroglia som "aktiveret".
Den nuværende metode foreslår en alternativ teknik til at generere microglia-kulturer ved hjælp af magnetisk cellesorteret teknologi. Med denne protokol høstes microglia kun få timer efter, at dyret dør uden noget samkulturtrin. Desuden dyrkes microglia kun 2 dage in vitro (DIV) før stimulering sammenlignet med 10-14 DIV, herunder samkultur i andre protokoller. Dette gør det muligt at komme tættere på de mikrogliale fysiologiske forhold. Denne procedure for dyrkning af microglia in vitro blev tidligere offentliggjort 25,26,27,28,29. Det nuværende arbejde præsenterede en optimeret protokol for nyfødte mus, standardiseret til at reducere antallet af anvendte dyr og uden myelinfjernelsestrin.
For at reducere antallet af mus, der bruges til primær microglia-kultur, besluttede vi at arbejde på P8 i OF1-stammen. På dette stadium af hjernens udvikling i OF1-belastning blev der opnået op til 750.000 mikroglialceller pr. hjerne i modsætning til 500.000 mikroglialceller pr. C57BL6/J-stammemushjerne i samme alder. C57BL6/J-stammen er blevet offentliggjort på et andet udviklingsstadium for microglia-kultur27,28. Den nuværende protokol er også blevet brugt med Fmr1KO-mus til at evaluere fagocytiske egenskaber af microglia forbundet med denne mutation og LysMCre: Dicerfl / + mus til vurdering af mikroglialaktiveringsfænotyper af RT-qPCR. Således er det lidt mere udfordrende at arbejde med C57BL/6 J musestamme end at arbejde på OF1-stamme på grund af (1) færre mikroglialceller pr. hjerne på samme udviklingsstadium og (2) skrøbelighed af microglia, der er mere tilbøjelige til at dø på grund af mekanisk aktivering (se afsnittet om fejlfinding).
Afhængigt af det udviklingsstadium, der er valgt til primær mikrogliakultur, skal myelinering overvejes, da den starter omkring P5. I en klassisk mikroglialkultur (ved P0-2) er myelinering ikke et problem; I andre offentliggjorte metoder til isolering af microglia fjernes myelin imidlertid ved hjælp af Percoll-gradient eller anti-myelin-antistoffer25,26,28,29. I den nuværende protokol aflives dyr på P8, når myelinering allerede er begyndt; Store mængder bruges til at skylle pellets, og den nydannede myelin kan fjernes uden yderligere procedure. Dette kan være en fejlfindingsmetode (se afsnittet Affald).
Producenten og tidligere offentliggjort mikroglial magnetisk isolering brugte DMEM F-12 medier suppleret med 10% FBS - 1% P / S 25,26,27,28,29. Biber et al.42 beskrev, at microglia sjældent kontakter serum in vivo. Faktisk indeholder centralnervesystemets ekstracellulære væske sjældent protein og bioaktive faktorer29. Derfor anvendes serumfri makrofag (SFM) medium + 1% P/S i denne protokol.
Magnetisk aktiveret cellesorteringsprotokol (MACS) kan også isolere og dyrke postnatal rottemikroglia med nogle ændringer25,29. Rottemikroglia isoleres faktisk ved hjælp af mikroperlebelagt anti-rotte CD11b / c. På grund af at hjernestørrelsen er større end P8-mus, bør der dog kun anvendes en hjerne pr. Dissociationsrør pr. Søjle. Microglia blev isoleret fra P10-14 rottehjerner i tidligere offentliggjorte protokoller, herunder myelineringsfjernelsestrin29. På trods af de tidligere kommentarer om dyrkningsmedium anbefales F-12-medier + 10% FBS og 550.000-600.000 celler pr. 12-brøndplade til downstream-applikationer til rotters mikroglialkultur.
Fejlfinding
Dissociation: Dissociationsblandingen som beskrevet i tabel 1 beregnes for den maksimale mængde hjerne, der kan dissocieres og fortsætte ved P8 i OF1-mus. Hvis der tilføjes mere hjerne, kan dissociation ikke afsluttes i slutningen af trin 3.2, og ikke-dissocieret hjernevæv vil blive fundet. I dette tilfælde anbefales det at køre NTDK-programmet på røret med ikke-dissocieret væv og holde de andre rør ved 4 °C.
Tilstoppet si og/eller kolonne: Som tidligere beskrevet beregnes dissociationsblandingen for den maksimale mængde hjernevæv, der kan passere gennem silen under trin 3.5. Hvis der tilføjes mere hjerne, kan filtreringen tage længere tid, men til sidst vil den passere igennem. Det anbefales at omhyggeligt resuspendere cellesuspension på toppen af silen, indtil al cellesuspension er filtreret.
Under trin 3.12 skal eksperimentatoren passere mærket cellesuspension gennem en søjle inde i magnetfeltet. Søjlen kan tilstoppes på dette stadium af proceduren (1), hvis for meget hjernevæv dissocieres pr. rør, (2) hvis resuspensionsvolumen ikke er korrekt, eller (3) hvis der er noget mekanisk induceret celledød (noget DNA kan være til stede); i så fald anbefales det at fjerne det synlige DNA med en 200 μL spids omhyggeligt.
Mekanisk induceret celledød og / eller aktivering: Protokollen beskrevet her udgør en hovedudfordring: at undgå mekanisk aktivering. For at gøre det er det vigtigt at pipettere forsigtigt og holde centrifugeringshastigheden lav. Hvis ikke, kan umodne microglia dø på grund af den mekaniske belastning eller blive aktiveret, hvilket fører til høj variation i RT-qPCR-resultater.
Affald: I dette forsøg aflives dyr på P8, når myelineringen lige er begyndt, og derfor er der ingen procedure til præcist at fjerne myelin. På dette udviklingsstadium kan myelin let fjernes ved centrifugering. Resuspensionsvolumener beskrevet i denne procedure beregnes for at fjerne det maksimale myelin. Hvis det ikke respekteres, kan myelin fremstå som celleaffald i kulturbrønde. Eksperimentatoren kan ikke helt fjerne det, når det observeres i kulturbrønde ved at skifte medium på dag 2. Mikroglialceller har tendens til at fagocyt dette affald, hvilket kan påvirke mikroglialaktiveringstilstanden før stimulering og dermed påvirke eksperimentel reproducerbarhed.
Alle tidligere beskrevne fejlfinding (Dissociation, Tilstoppet si og/eller kolonne, mekanisk induceret celledød og/eller aktivering og snavs) kan føre til variation i antallet af CD11b+ celler, der opnås ved celletælling (figur 5B). Vi anbefaler at være meget opmærksom på dette for at optimere det endelige celleudbytte.
Forurening: I denne protokol dyrkes mikrogliaceller i SFM-medium + 1% P / S. SFM-medium kan let forurenes. Derfor anbefales det at aliquotere mediet i 50 ml rør efter tilsætning af P/S for at undgå medium kontaminering. Desuden skal alle eksperimenter udføres så meget som muligt under sterile forhold.
mRNA kvantitet / kvalitet: Vores team arbejder på miRNA eller siRNA transfektioner. Den nuværende protokol er yderst kompatibel med sådanne anvendelser ved hjælp af magnetisk transfektion med en lille ændring af protokollen; eksperimentatoren skal høste 700.000 celler pr. 12-brøndplade for at få mRNA af høj kvalitet til RT-qPCR. Selvom RNAseq ikke udføres i denne undersøgelse, udførte vores team tidligere mRNA-ekstraktion for RNAseq ved hjælp af 500.000 celler pr. 12-brøndplade48.
Afslutningsvis kan denne protokol gengives, og det forventes at være en ny standard for isolering af microglia på et ungt udviklingsstadium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Tallene er skabt ved hjælp af BioRender. Forskningen er finansieret af Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, og et yderligere tilskud fra Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS og Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit - Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
References
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
- Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
- Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
- Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
- Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
- Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
- Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
- Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
- Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
- Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
- Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
- Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
- Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
- Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
- You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
- Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
- Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
- Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
- Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L.
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
- Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
- Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
- Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
- Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
- Fleiss, B., et al.
- Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
- Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
- Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
- Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
- Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
- Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
- Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal 'On' and 'Off' signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
- Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
- Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, Suppl. 1 117-125 (2009).
- Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).
