一种有效的黑胡椒植 酸菌 接种方法

Summary

针刺黑胡椒植物的基部头部是一种简短而省时的方法来破坏它。在这里，我们提供了感染黑胡椒植物的视频的详细步骤。

Abstract

胡椒 是一种典型的木本藤，是一种经济上重要的香料作物。黑胡椒生产受到 辣椒疫霉引起的根腐病害的显著影响，这严重影响了行业发展，成为一个“瓶颈”问题。然而，黑胡椒抗性的分子遗传机制尚不清楚，导致黑胡椒新品种的开发进展缓慢。黑胡椒植物上 辣椒疫 霉菌的有效接种和精确采样系统对于研究这种植物 - 病原体相互作用至关重要。本研究的主要目的是展示一种详细的方法，其中黑胡椒的基部头部接种了 辣椒疫霉，同时也为木本藤植物的接种提供了参考。黑胡椒植物的基部头部被针刺以破坏它，菌丝颗粒覆盖了三个孔以保留水分，因此病原体可以很好地感染植物。这种方法提供了一种更好的方法来解决由传统接种方法（包括土壤淋湿或根部浸渍）引起的不稳定性。它还为研究农业精准育种中植物与其他土源性植物病原菌的作用方式提供了一种有希望的途径。

Introduction

黑胡椒（胡椒黑胡椒 L.）是一种木质攀岩者，也是最重要的香料作物之一。它被称为“香料之王”¹ ，在亚洲，非洲和拉丁美洲的40多个国家和地区种植。疫霉根腐病是黑胡椒最具破坏性的疾病，是由卵菌 衣花疫霉引起的。这种病原体还感染葫芦，茄子，辣椒和西红柿^2，3。使用黑胡椒，整个作物有时会被这种疾病摧毁。由于抗性品种的缺乏，辣椒种植面积的扩大受到限制，这严重阻碍了中国黑胡椒产业的发展。黑胡椒植物上 辣椒疫 霉菌的有效接种和精确采样系统对于研究这种植物 - 病原体相互作用至关重要。

种质资源抗性鉴定与筛选是研究病原菌致病性及抗性品种育种利用的基本要求。一种广泛使用的方法是使用基于植物物种和病原体群体的各种鉴定方法。目前的鉴定方法包括群体鉴定、个体鉴定、器官鉴定、组织鉴定、细胞鉴定、生化鉴定、分子鉴定等，近年来已发展起来^4、5。在这些领域取得了成功，但也存在许多问题。无论选择哪种方法，植物抗性鉴定的基本要求都是一致的，包括目标明确，结果可靠，方法简单、快速、易于标准化。在识别黑胡椒耐药性时也必须遵循这一原则。

在自然野外条件下，抗病性的识别可能受到许多环境因素的影响。因此，建议在实验室中使用分离的叶子和灌溉的根来识别抗病性。在实验室 中体外 接种健康植物的嫩叶，并通过接种病原体来测量患病叶片面积，以鉴定植物的抗病性⁶。然而， 体外 叶片接种只能用于一般抗性鉴定，而不能用于分子相互作用研究。尽管如此，抗病状态经常出现在灌溉根系接种中，导致抗病分子育种的后续研究存在不确定性。因此，快速简单的室内检测方法至关重要。本研究旨在提供一种在实验室中鉴定耐药性的方法。

Protocol

1. 黑胡椒切植株的制备

1. 使用消毒的修剪刀或分离器，从健康且生长旺盛的正交各向异性黑胡椒枝中取出长约40厘米，直径约40厘米的五节点切枝。修剪斜向性分支的下三个节点，上部两个节点留下大约10个叶子完好无损。
2. 以1：1的比例制备含有土壤和动物粪便（牛粪或羊粪）的生根基质。将生根基质在121°C高压灭菌20分钟。
3. 将插条以约50°的角度插入生根基质中，第三个节点刚好接触基质的表面，并且该节点上的腋窝芽在基质上方。
   注意：这里使用的袋子有以下尺寸：高度为40-60厘米，直径为25-30厘米。
4. 将10-20升水倒在植物的根部。将插条置于90%阴凉处的温室中，温度为25-30°C，用于生根和生长。

2. 辣椒疫 霉（辣椒蚜虫）的繁殖

注： 辣椒疫霉 菌的库存保存在中国热带农业科学院香料饮料研究所的植物保护实验室⁷。

1. 在流动的自来水中刷洗马铃薯块茎，然后将200克马铃薯切成1厘米³的立方体。将一些立方体放入装有800毫升双蒸馏水（ddH₂O）的烧杯中，煮沸20分钟。
2. 使用重力过滤通过双纱布过滤肉汤。通过将20克葡萄糖和15克琼脂加入滤液中来制备马铃薯葡萄糖琼脂（PDA），并用ddH₂O将体积加至1L。
3. 将20 mL液体形式的灭菌PDA倒入层流罩内直径9厘米的圆形培养皿中。将带盖子的PDA板放在层流罩内过夜，以防止冷凝。
4. 使用接种环从试管内的荚果 荚蒾 中拾取菌丝体。将菌丝侧与PDA接触的接种物放入培养皿中。

3. 黑胡椒感染

1. 孵化
   1. 确定基质表面上方5厘米处靠近茎上的根部的区域以进行接种。
   2. 在PDA上使用塞蛀虫在培养皿中的PDA上生长边缘取芯一个直径为0.5厘米的菌丝体盘。
   3. 使用注射器针头损坏茎，并在选定的接种区域以三角形图案打出三个孔。用菌丝盘覆盖每个孔。将孔彼此靠近放置，以确保受伤区域完全被菌丝盘覆盖。
   4. 用灭菌的湿润化妆棉覆盖菌丝体椎间盘，以防止干燥。用聚乙烯条将垫子绑在茎上，以保持接种盘的位置。
      注意：接种后8小时，接种的孔变黑，病灶随着时间的流逝而扩大。叶子变黄并脱落，接种的植物在接种后7-10天死亡。对照植物中未出现病变。与对照组相比，大多数基因在接种 衣帽疫 杆菌后表达不同。感染组织的组织病理学分析表明， 辣椒疫霉菌 定植于木质部。
2. 对感兴趣的植物材料进行取样，并在-80°C下储存在液氮中，以用于后续研究。
   注意：在实验之前准备了液氮，塑料袋，记号笔，支剪和其他材料。
3. 在对特定植物材料进行取样以供使用后，高压灭菌所有剩余的植物材料，剩余的 辣椒疫霉菌 培养物和培养基，以及用于该接种工作的所有仪器和实验室器具。

Representative Results

图1 显示了辣椒假单 胞菌 接种后黑胡椒叶的症状。 图2 显示了 辣椒假单胞菌 接种后黑胡椒茎的症状。病原体在基茎处感染黑胡椒;症状包括叶变黄，出现枯萎，木质部褐变和血管逐渐变黑。图3 显示了与对照组相比，接种 辣椒疫 霉后表达的大多数基因不同。 图4 通过对感染组织的组织病理学分析证明 辣椒疫霉菌 定植于木质部。

图1：辣椒 假单胞菌 接种后黑胡椒叶的症状⁷. CK：对照组;接种：接种后。 请点击此处查看此图的大图。

图2：辣椒假单 胞菌 接种后黑胡椒茎的症状⁷。 接种：接种后。 请点击此处查看此图的大图。

图3：黑胡椒根中基因的详细表达谱。 图中的误差线表示三种生物复制的表达水平的标准误差。x轴上的CK-8，CK-12，CK-24，CK-48，8，12，24和48分别是指对照组的8，12，24和48小时以及 接种辣椒假单胞菌后的8，12，24和48小时。y轴表示与泛素相比的相对表达水平。每列代表三个生物重复的平均值加上SD（标准偏差）。 请点击此处查看此图的大图。

图4：感染组织的组织病理学分析。 甲苯胺蓝单独O染色（左列）与棉蓝和沙夫兰宁O双重染色（右列）（20X）的比较。 请点击此处查看此图的大图。

Discussion

在这项研究中，基部头部被针刺损伤，并在黑胡椒植物中提供了有效的接种系统。然后，菌丝颗粒覆盖三个孔以保持水分并使病原体能够很好地感染植物。接种后，叶子变黄并脱落，接种的植物死亡。对照植物中未出现病变。与对照组相比，大多数基因在接种 衣帽疫 杆菌后表达不同。真菌病害是造成大量作物结构和生理紊乱的原因，导致生产力下降和生产者的经济损失。采用组织学技术对真菌穿透和定植植物组织模式的结构研究提供了病原体与植物组织之间相互作用的详细指示。这些研究揭示了帮助理解疾病单周期的重要方面。感染组织的组织病理学分析显示 ，辣椒疫霉菌 定植于木质部。这种方法为解决传统接种方法（包括土壤淋湿或根部浸渍）引起的不稳定性提供了更好的方法。黑胡椒植物上 辣椒疫 霉的有效接种和精确采样系统对于研究这种植物 - 病原体相互作用至关重要。它还为研究农业精准育种中植物与其他土源性植物病原菌的作用方式提供了一种有希望的途径。

同时，该协议代表了一种更有效的方式，为木本藤的孵化提供参考。在以前的研究中，病原体是通过根浸渍在V8培养基9中培养的孢子悬浮液接种^的。孢子悬浮液需要7天才能准备好，而使用PDA培养 辣椒疫 霉菌只需要5天。PDA板使用可渗透的手术胶带密封，以避免其他细菌和真菌的污染。培养物在室温下保存。本研究中使用的方法可以节省更多时间并更快地执行。黑胡椒是一种木本藤，含有许多糖和酚^类10， 辣椒疫霉 产生的游动孢子一般发生在土壤中，使其难以感染黑胡椒藤，引起根¹¹的感染不稳定。该方案提供更好的结果，使藤本植物和土壤传播的病原体之间能够产生强烈的相互作用。植物与病原菌之间动态过程的检测是可见的，方便的。

根部灌溉方法快速省时，但黑胡椒的问题仍未解决。 荚膜疫霉 是一种土源性病原体，通常 通过 孢子囊和游动孢子感染植物根^{系 12}.在自然界中，孢子囊 能够通过雨水和 灌溉传播。一旦游动孢子附着在植物表面，胚管可能迅速发育并穿透植物组织，这导致感染^13，14。这可能会导致不确定性，选择菌丝作为感染源将类似于孢子悬浮液。本研究中使用的方法从针刺黑胡椒植物的基部头部开始破坏它。然后用 荚膜疫霉 覆盖受损区域并保留水分，确保病原体可以很好地感染植物。这种方法更能解决传统接种方法（包括土壤淋湿或根部浸渍）引起的不稳定性。在农业精准育种中，研究植物与其他土源性植物病原菌的作用方式也是一种很有前途的方法。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar powder	Solarbio	A8190
Clean bench	Haier
Dextrose	Xilong Scientific	15700501
High temperature sterilizing oven	Zaelway
Petri dish plates	Biosharp	BS-90-D