Summary
Karabiber bitkisinin bazal kafasını iğnelemek, ona zarar vermek için kısa ve zaman kazandıran bir yöntemdir. Burada, karabiber bitkilerini enfekte etmek için bir video ile ayrıntılı adımlar sağladık.
Abstract
Piper nigrum L. (karabiber), dünya çapında ekonomik açıdan önemli bir baharat ürünü olan tipik bir odunsu asmadır. Karabiber üretimi, bir "boğulma noktası" sorunu olarak endüstri gelişimini ciddi şekilde etkileyen Phytophthora capsici'nin neden olduğu kök çürüklüğü hastalığından önemli ölçüde etkilenmektedir. Bununla birlikte, karabiberdeki direncin moleküler genetik mekanizması belirsizdir ve bu da yeni karabiber çeşitlerinin geliştirilmesinde yavaş ilerlemeye yol açmaktadır. Karabiber bitkilerinde Phytophthora capsici için etkili bir aşılama ve hassas örnekleme sistemi, bu bitki-patojen etkileşimini incelemek için gereklidir. Bu çalışmanın temel amacı, karabiberin bazal başının Phytophthora capsici ile aşılandığı ayrıntılı bir metodolojiyi göstermek ve aynı zamanda odunsu asma bitkilerinin aşılanması için bir referans sağlamaktır. Karabiber bitkisinin bazal kafası, ona zarar vermek için iğnelendi ve misel topakları, nemi korumak için üç deliği kapladı, böylece patojen bitkiyi iyi enfekte edebildi. Bu yöntem, toprak damlatma veya kök daldırma dahil olmak üzere geleneksel aşılama yöntemlerinin neden olduğu dengesizliği çözmenin daha iyi bir yolunu sağlar. Ayrıca, tarımsal hassas ıslahta bitkiler ve diğer toprak kaynaklı bitki patojenleri arasındaki etki şeklini incelemek için umut verici bir araç sağlar.
Introduction
Karabiber (Piper nigrum L.) odunsu bir tırmanışçı ve en önemli baharat bitkilerinden biridir. "Baharatların Kralı"1 olarak bilinir ve Asya, Afrika ve Latin Amerika'da 40'tan fazla ülke ve bölgede yetiştirilir. Phytophthora kök çürüklüğü, karabiberin en yıkıcı hastalığıdır ve oomisit Phytophthora capsici'den kaynaklanır. Bu patojen ayrıca salatalıkları, patlıcanları, acı biberleri ve domatesleri de enfekte eder 2,3. Karabiber ile, bütün bir ürün bazen bu hastalık tarafından yok edilebilir. Biber ekim alanlarının genişlemesi, Çin karabiber endüstrisinin gelişimini önemli ölçüde engelleyen dirençli çeşitlerin bulunmamasının bir sonucu olarak kısıtlanmıştır. Karabiber bitkilerinde Phytophthora capsici için etkili bir aşılama ve hassas bir örnekleme sistemi, bu bitki-patojen etkileşimini incelemek için gereklidir.
Germplazma kaynaklarında direncin tanımlanması ve taranması, patojenin patojenitesinin araştırılması ve dirençli çeşitlerin ıslahı ve kullanılması için temel gerekliliktir. Yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım, bitki türlerine ve patojen gruplarına dayanan çeşitli tanımlama yöntemleri kullanmaktır. Güncel tanımlama yöntemleri, son yıllarda geliştirilen popülasyon tanımlama, bireysel tanımlama, organ tanımlama, doku tanımlama, hücre tanımlama, biyokimyasal tanımlama ve moleküler tanımlamayı içerir 4,5. Bu alanlarda başarılar elde edildi ama birçok sorun da var. Hangi yöntem seçilirse seçilsin, tesis direnci tanımlamanın temel gereksinimleri, net hedefler, güvenilir sonuçlar ve basit, hızlı ve standartlaştırılması kolay yöntemler dahil olmak üzere tutarlıdır. Karabiber direncinin belirlenmesinde de bu ilkeye uyulmalıdır.
Doğal alan koşullarında, hastalık direncinin tanımlanması birçok çevresel faktörden etkilenebilir. Bu nedenle, hastalık direncini tanımlamak için laboratuvarda müstakil yaprakların ve sulanan köklerin kullanılması önerilmiştir. Sağlıklı bitkilerden elde edilen genç yapraklar laboratuvarda in vitro olarak aşılandı ve bitkilerin hastalık direncini belirlemek için patojen aşılanarak hastalıklı yaprak alanı ölçüldü6. Bununla birlikte, in vitro yaprak aşılaması, moleküler etkileşim çalışmaları için değil, yalnızca genel direnç tanımlaması için kullanılabilir. Buna rağmen, hastalığa dirençli durum sıklıkla sulanan kök aşılamasında ortaya çıkar ve hastalık direnci için moleküler ıslahın takip çalışmasında belirsizliğe neden olur. Bu nedenle, hızlı ve basit iç mekan algılama yöntemleri çok önemlidir. Bu çalışma, laboratuvarda direnç tanımlaması için bir yöntem sunmayı amaçlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Karabiber kesme tesislerinin enfeksiyon için hazırlanması
- Dezenfekte edilmiş bir budama bıçağı veya secateurs kullanarak sağlıklı ve kuvvetli bir şekilde büyüyen ortotropik bir karabiber dalından 0,5 cm çapında yaklaşık 40 cm uzunluğunda beş düğümlü bir kesim yapın. Plagiotropik dalların alt üç düğümünü budayın, üst iki düğüm yaklaşık 10 yaprak bozulmadan kalır.
- Toprak ve hayvan gübresi (gübresi veya koyun gübresi) içeren köklenme substratını 1: 1 oranında hazırlayın. Köklenme substratını 20 dakika boyunca 121 °C'de otoklav yapın.
- Kesimleri köklenme substratına yaklaşık 50°'lik bir açıyla yerleştirin, üçüncü düğüm sadece substratın yüzeyine ve substratın üzerindeki bu düğümdeki aksiller tomurcuklara dokunur.
NOT: Burada kullanılan torba şu boyutlara sahiptir: 40-60 cm yükseklik, 25-30 cm çap. - Bitkinin köklerinin üzerine 10-20 L su dökün. Kesimleri, köklenme ve büyüme için 25-30 ° C sıcaklıkta% 90 gölgeli bir seraya yerleştirin.
2. Phytophthora capsici'nin (P. capsici) yayılması
NOT: Çin Tropikal Tarım Bilimleri Akademisi7, Baharat ve İçecek Araştırma Enstitüsü'nün bitki koruma laboratuvarında bir Phytophthora capsici kültürü stoğu tutulmaktadır.
- Patates yumrularını akan musluk suyunun altında fırçalayın ve temizleyin ve ardından 200 g patatesi 1cm3'lük küpler halinde kesin. Bazı küpleri 800 mL çift damıtılmış su (ddH 2 O) içeren bir beherin içine yerleştirin ve20dakika kaynatın.
- Yerçekimi filtrasyonu kullanarak suyu çift gazlı bezle filtreleyin. Filtrata 20 g dekstroz ve 15 g agar ekleyerek veddH 2O ile 1 L'ye kadar olan hacmi doldurarak patates dekstroz agarını (PDA) hazırlayın. karışımı 121 ° C'de 20 dakika8 boyunca otoklav edin.
- Sterilize edilmiş PDA'nın 20 mL'sini sıvı halde laminer hava akış davlumbazının içine 9 cm çapında yuvarlak bir Petri kabına dökün. Yoğuşmayı önlemek için kapakları laminer hava akış davlumbazının içinde kapakları açık olan PDA plakalarını gece boyunca açık bırakın.
- Bir test tüpü içindeki Phytophthora capsici stoğundan miseliyi almak için bir aşılama döngüsü kullanın. İnokulumu, PDA ile temas halinde misel tarafı ile bir Petri kabına yerleştirin.
3. Karabiber enfeksiyonu
- Kuluçka
- Substrat yüzeyinin 5 cm yukarısında ve aşılama için gövdedeki köklere yakın bir alan tanımlayın.
- Bir tıpa delici kullanarak bir Petri kabında PDA üzerindeki Phytophthora capsici kültürünün büyüyen kenarında 0,5 cm çapında miselya çapında bir disk oluşturur.
- Bir şırınga iğnesi kullanarak gövdeye zarar verin ve seçilen aşılama alanında üçgen bir desende üç delik açın. Her deliği bir misel diski ile örtün. Yaralı bölgenin misel diskleriyle tamamen kaplandığından emin olmak için delikleri birbirine yakın konumlandırın.
- Misel disklerini, kurumayı önlemenin bir yolu olarak sterilize edilmiş nemlendirilmiş pamuklu pedlerle örtün. Aşılama disklerinin konumunu korumak için pedi gövdeye bir polietilen şeritle bağlayın.
NOT: Aşılamadan 8 saat sonra aşılanan delikler siyaha döndü ve lezyon zaman geçtikçe uzadı. Yapraklar sarardı ve düştü ve aşılanan bitki aşılamadan 7-10 gün sonra öldü. Kontrol tesislerinde lezyon gelişmedi. Genlerin çoğu, kontrol grubuna kıyasla Phytophthora capsici ile aşılamayı takiben farklı şekilde eksprese edildi. Enfekte dokuların histopatolojik analizi, Phytophthora capsici'nin ksilemde kolonize olduğunu göstermiştir.
- İlgilenilen bitki malzemelerini numune alın ve sonraki çalışmalarda kullanılmak üzere -80 ° C'de sıvı azotta saklayın.
NOT: Deneylerden önce sıvı azot, plastik torbalar, işaretleyici kalemler, dal makasları ve diğer malzemeler hazırlanmıştır. - Belirli bitki materyalleri kullanım için örneklendikten sonra, kalan tüm bitki materyallerini, kalan Phytophthora capsici kültür ve kültür ortamını ve bu aşılama çalışmasında kullanılan tüm aletleri ve laboratuar malzemelerini otoklav edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 , P. capsici aşılamasını takiben karabiber yapraklarının semptomlarını göstermektedir. Şekil 2 , P. capsici aşılamasını takiben karabiber saplarının semptomlarını göstermektedir. Patojen, karabiberi bazal gövdede enfekte etti; yaprak sararması, solgunluğun ortaya çıkması, ksilem kahverengileşmesi ve damar kararmasının yavaş yavaş ortaya çıkması gibi semptomlar. Şekil 3 , Phytophthora capsici ile aşılamadan sonra kontrol grubuna kıyasla farklı şekilde ifade edilen genlerin çoğunu göstermektedir. Şekil 4 , enfekte olmuş dokuların histopatolojik analizi ile ksilemde kolonize edilen Phytophthora capsici'yi göstermiştir.
Şekil 1: P. capsici aşılamasını takiben karabiber yapraklarının belirtileri7. CK: kontrol grubu; Aşılanmış: aşılamadan sonra. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Karabiber belirtisi P. capsici aşılama7'den sonra ortaya çıkar. Aşılanmış: aşılamadan sonra. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Karabiber köklerindeki genlerin detaylı ekspresyon profilleri. Şekillerdeki hata çubukları, üç biyolojik replikasyondan gelen ifade seviyelerinin standart hatasını gösterir. X ekseninde CK-8, CK-12, CK-24, CK-48, 8, 12, 24 ve 48, P. capsici ile aşılamayı takiben sırasıyla kontrolde 8, 12, 24 ve 48 saat ve 8, 12, 24 ve 48 saat anlamına gelir. Y ekseni, ubikitin ile karşılaştırıldığında göreceli ifade seviyesini temsil eder. Her sütun, ortalama değeri artı üç biyolojik kopyadan SD (standart sapma) temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Enfekte dokuların histopatolojik analizi. Tek başına toluidin mavisi O boyama (sol sütun) ile pamuk mavisi ve safranin O çift boyama (sağ kolon) (20X) arasındaki karşılaştırma. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, karabiber bitkisinde bazal kafa hasara ve etkili bir aşılama sistemi sağlamak için iğnelenmiştir. Misel peletleri daha sonra nemi korumak ve patojenin bitkiyi iyi enfekte etmesini sağlamak için üç deliği kapladı. Aşılamayı takiben, yapraklar sararmaya başladı ve düştü ve aşılanan bitkiler öldü. Kontrol tesislerinde lezyon gelişmedi. Çoğu gen, kontrol grubuna kıyasla Phytophthora capsici ile aşılamayı takiben farklı şekilde eksprese edildi. Mantar hastalıkları, önemli sayıda üründeki yapısal ve fizyolojik bozukluklardan sorumludur ve bu da üretkenliklerinin azalmasına ve üreticileri için ekonomik kayıplara yol açmaktadır. Bitki dokularının mantarlar tarafından penetrasyon ve kolonizasyon şekli üzerine histolojik teknikler kullanan yapısal çalışmalar, patojen ve bitki dokusu arasındaki etkileşimlerin ayrıntılı bir göstergesidir. Bu çalışmalar, hastalıkların monodöngüsünü anlamaya yardımcı olacak önemli yönleri ortaya koymuştur. Enfekte dokuların histopatolojik analizinde Phytophthora capsici'nin ksilemde kolonize olduğu görüldü. Bu yöntem, toprak damlatma veya kök daldırma dahil olmak üzere geleneksel aşılama yöntemlerinin neden olduğu dengesizliği çözmek için daha iyi bir araç sağlar. Karabiber bitkilerinde Phytophthora capsici için etkili bir aşılama ve hassas örnekleme sistemi, bu bitki-patojen etkileşimini incelemek için gereklidir. Ayrıca, tarımsal hassas ıslahta bitkiler ve diğer toprak kaynaklı bitki patojenleri arasındaki etki şeklini incelemek için umut verici bir araç sağlar.
Aynı zamanda, bu protokol odunsu asmanın inkübasyonu için referans sağlamanın daha etkili bir yolunu temsil eder. Önceki çalışmalarda, patojenler V8 orta9'da kültürlenen spor süspansiyonları ile kök daldırma ile aşılandı. Spor süspansiyonunun hazır olması 7 gün sürerken, PDA'nın Phytophthora capsici kültürüne kullanımı sadece 5 gün sürer. PDA plakası, diğer bakteri ve mantarlardan kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için geçirgen cerrahi bant kullanılarak kapatıldı. Kültürler oda sıcaklığında tutuldu. Bu çalışmada kullanılan yöntem daha fazla zaman kazandırabilir ve daha hızlı uygulanabilir. Karabiber, birçok şeker ve fenol içeren odunsu bir asmadır10 ve Phytophthora capsici tarafından üretilen zoosporlar genellikle topraklarda meydana gelir, bu da karabiber asmalarını enfekte etmeyi zorlaştırır ve kök11'de enfeksiyon dengesizliğine neden olur. Bu protokol, asma bitkileri ve toprak kaynaklı patojenler arasında güçlü bir etkileşim sağlayarak daha iyi sonuçlar sağlar. Bitkiler ve patojenler arasındaki dinamik sürecin tespiti görünür ve kullanışlıdır.
Sulama kökü yöntemi hızlı ve zaman kazandırıcıdır, ancak karabiber için bir sorun çözülmeden kalır. Phytophthora capsici, genellikle bitki köklerini sporangia ve zoosporlar yoluyla enfekte eden toprak kaynaklı bir patojendir12. Doğada, sporangia yağmur ve sulama yoluyla yayılabilir. Zoosporlar bitki yüzeyine bağlandığında, germ tüpleri hızla gelişebilir ve bitki dokusuna nüfuz edebilir, bu da enfeksiyona neden olur13,14. Bu, bir enfeksiyon kaynağı olarak hiflerin seçilmesinin spor süspansiyonuna benzer olacağından emin olamayacağına neden olabilir. Bu çalışmada kullanılan yöntem, karabiber bitkisinin bazal kafasını zarar vermek için iğnelemekle başlar. Hasarlı alan daha sonra Phytophthora capsici ile kaplanır ve nem korunur, böylece patojenin bitkiyi iyi enfekte edebilmesi sağlanır. Bu yöntem, toprak drench veya kök daldırma dahil olmak üzere geleneksel aşılama yöntemlerinin neden olduğu dengesizliği çözmede daha iyidir. Aynı zamanda, tarımsal hassas ıslahta bitkiler ve diğer toprak kaynaklı bitki patojenleri arasındaki etki şeklini incelemek için umut verici bir yöntemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2020YFD1001200), Çin Tarım Araştırma Sistemi (CARS-11), Hainan Eyaleti Akademisyenleri için İnovasyon Platformu'nun özel araştırma fonu (YSPTZX202154), Çin'in Hainan Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (321RC652) ve Çin Doğa Bilimleri Vakfı (No. 31601626) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder | Solarbio | A8190 | |
| Clean bench | Haier | ||
| Dextrose | Xilong Scientific | 15700501 | |
| High temperature sterilizing oven | Zaelway | ||
| Petri dish plates | Biosharp | BS-90-D |
References
- Gordo, S. M., et al. High-throughput sequencing of black pepper root transcriptome. BMC Plant Biology. 12 (1), (2012).
- Leonian, L. H. Stem and fruit blight of Peppers caused by Phytophthora capsici sp. Nov. Phytopathology. 12 (9), 401-408 (1922).
- Ding, X., et al. Priming maize resistance by its neighbors: Activating 1,4-benzoxazine-3-ones synthesis and defense gene expression to alleviate leaf disease. Frontiers in Plant Science. 6, 830 (2015).
- Fonseca, C. E. L., Vianda, D. R., Hansen, J. L., Pell, A. N. Associations among forage quality traits, vigor, and disease resistance in alfalfa. Crop Science. 39 (5), 1271-1276 (1999).
- Altier, N. A., Thies, J. A. Identification of resistance to Pythium seedling disease in Alfalfa using a culture plate method. Plant Disease. 79 (4), 341-345 (1995).
- Pratt, R. G., Rowe, D. E. Evaluation of simplified leaf inoculation procedures for identification of quantitative resistance to Sclerotinia trifoliorum in Alfalfa seedling. Plant Disease. 82 (10), 1161-1164 (1998).
- Hao, C., et al. De novo transcriptome sequencing of black pepper (Piper nigrum L.) and an analysis of genes involved in phenylpropanoid metabolism in response to Phytophthora capsici. BMC Genomics. 17 (1), 1-14 (2016).
- Dong, C., et al. Field inoculation and classification of maize ear rot caused by Fusarium verticillioides. Bio-protocol. 8 (23), 3099 (2018).
- English, J. T., Laday, M., Bakonyi, J., Schoelz, J. E., Érsek, T. Phenotypic and molecular characterization of species hybrids derived from induced fusion of zoospores of Phytophthora capsica and Phytophthora nicotianae. Mycological Research. 103 (8), 1003-1008 (1999).
- Chatterjee, S., et al. Antioxidant activity of some phenolic constituents from green pepper (Piper nigrum L.) and fresh nutmeg mace (Myristica fragrans). Food Chemistry. 101 (2), 515-523 (2007).
- Pfender, W. F. Production of sporangia and release of zoospores by Phytophthora megasperma in soil. Phytopathology. 67 (5), 657-663 (1977).
- Nagila, A., Schutte, B. J., Sanogo, S., Idowu, O. J. Chile pepper sensitivity to mustard seed meal applied after crop emergence. HortScience. 56 (2), 1-7 (2021).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsica. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Hardham, A., Gubler, F. Polarity of attachment of zoospores of a root pathogen and pre-alignment of the emerging germ tube. Cell Biology International Reports. 14 (11), 947-956 (1990).
