Summary
黒胡椒植物の基礎頭をピンチすることは、それを傷つけるための短くて時間を節約する方法です。ここでは、黒胡椒植物に感染するためのビデオで詳細な手順を提供しました。
Abstract
パイパーニグラム L.(黒胡椒)は、世界中で経済的に重要なスパイス作物である典型的な木質のつるです。黒胡椒の生産は、 Phytophthora capsiciによって引き起こされる根腐れ病によって大きく影響を受けており、「チョークポイント」の問題として業界の発展に深刻な影響を与えています。しかし、黒胡椒の抵抗性の分子遺伝学的メカニズムは不明であり、新しい黒胡椒品種の開発の進展が遅い。黒胡椒植物に対する Phytophthora capsici の効果的な接種と正確なサンプリングシステムは、この植物 - 病原体相互作用を研究するために不可欠です。この研究の主な目的は、黒胡椒の基底頭部に Phytophthora capsiciを接種する詳細な方法論を実証することであり、同時に木質ブドウ植物の接種のための参照を提供することである。黒胡椒植物の基底頭はそれを傷つけるためにピンチで刺され、菌糸ペレットは病原体が植物によく感染できるように水分を保持するために3つの穴を覆った。この方法は、土壌灌漑または根浸漬を含む伝統的な接種方法によって引き起こされる不安定性を解決するより良い方法を提供する。また、農業精密育種における植物と他の土壌媒介性植物病原体との間の作用機序を研究するための有望な手段を提供する。
Introduction
ブラックペッパー(パイパーニグラムL.)は、ウッディクライマーであり、最も重要なスパイス作物の1つです。「スパイスの王様」1として知られ、アジア、アフリカ、ラテンアメリカの40以上の国と地域で栽培されています。Phytophthora root rotは、黒胡椒の最も壊滅的な病気であり、卵菌Phytophthora capsiciによって引き起こされます。この病原体は、ウリ科植物、ナス、唐辛子、トマトにも感染します2,3。黒コショウでは、作物全体がこの病気によって間引かれることがあります。コショウの植え付け面積の拡大は、抵抗性品種が利用できないために制限されており、中国の黒コショウ産業の発展を著しく妨げています。黒胡椒植物に対するPhytophthora capsiciの効果的な接種と正確なサンプリングシステムは、この植物 - 病原体相互作用を研究するために不可欠です。
生殖質資源中の抵抗性の同定とスクリーニングは、病原体の病原性および抵抗性品種の育種および利用を研究するための基本的な要件である。広く使用されているアプローチは、植物種および病原体群に基づく様々な同定方法を使用することである。現在の同定方法には、近年開発されている集団同定、個体同定、臓器同定、組織同定、細胞同定、生化学的同定、および分子同定が含まれる4,5。これらの分野では成功していますが、多くの問題もあります。どの方法を選択しても、明確な目的、信頼性の高い結果、シンプルで迅速で標準化が容易な方法など、植物抵抗性の識別の基本的な要件は一貫しています。この原理は、黒胡椒耐性の同定においても従わなければならない。
自然界の条件下では、病害抵抗性の同定は多くの環境要因の影響を受ける可能性があります。そこで、剥離した葉や灌漑した根を実験室で使用して病害抵抗性を同定することが提案された。健康な植物由来の若葉を実験室 でインビトロで 接種し、病原体を接種して病原体を接種して病害葉面積を測定し、植物体の病害抵抗性を同定した6。しかし、 in vitro 葉接種は、一般的な耐性同定にのみ使用でき、分子間相互作用研究には使用できません。それにもかかわらず、灌漑根接種において病害抵抗性状態がしばしば現れ、病害抵抗性のための分子育種の追跡研究において不確実性を引き起こす。したがって、迅速かつ簡単な屋内検出方法が不可欠です。本研究は、実験室における抵抗同定の方法を提供することを目的とする。
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Protocol
1.感染のための黒胡椒切断植物の調製
- 消毒された剪定ナイフまたはセカテュールを使用して、黒コショウの健康で活発に成長している直交異方性の枝から、直径0.5cmの長さ約40cmの5節切断を行います。剽窃枝の下の3つの節を剪定し、上の2つの節には約10枚の葉がそのまま残っています。
- 土壌と動物の糞尿(牛糞または羊糞)を含む発根基質を1:1の比率で準備する。発根基質をオートクレーブで121°Cで20分間処理した。
- 3番目のノードが基板の表面に触れ、基板の上のこのノード上の腋窩芽がちょうど触れるように、約50°の角度で発根基板に挿し木を挿入します。
注:ここで使用されるバッグの寸法は、高さ40~60 cm、直径25~30 cmです。 - 植物の根の上に10〜20Lの水を注ぐ。挿し木を90%日陰の温室に25〜30°Cの温度で置き、発根と成長をします。
2. フィトフトラ・カプシチ (P. capsici)の伝播
注: Phytophthora capsici 培養のストックは、中国熱帯農業科学院スパイスおよび飲料研究所の植物保護研究所で維持されています7。
- 水道水の下でジャガイモ塊茎をブラッシングしてきれいにし、200gのジャガイモを1cm3の立方体に切ります。キューブの一部を800mLの二重蒸留水(ddH2O)を含むビーカーに入れ、20分間沸騰させる。
- 重力ろ過を使用して二重ガーゼを通してスープをろ過する。濾液にデキストロース20gと寒天15gを加え、混合物を121°Cで20分間ddH2Oオートクレーブで1Lまでの体積にトッピングすることによって、ジャガイモデキストロース寒天(PDA)を調製する8。
- 滅菌したPDA20mLを液体状で層流フード内の直径9cmの丸いシャーレに注ぐ。結露を防ぐ手段として、層流フードの内側に蓋を開けたPDAプレートを一晩放置してください。
- 接種ループを使用して、試験管内の Phytophthora capsici ストックから菌糸体を拾います。PDAと接触する菌糸側を有する接種物をペトリ皿に入れる。
3.黒胡椒の感染
- 潜伏
- 接種のために、基質表面から5cm上および根に近い領域を特定する。
- ストッパーボーラーを用いてPDA上の Phytophthora capsici 培養物の成長端に直径0.5cmの菌糸体のディスクをペトリ皿にコアアウトする。
- シリンジ針を使用して茎を損傷し、選択した接種領域で三角形のパターンに3つの穴を開けます。各穴を菌糸体ディスクで覆います。穴を互いに近づけて、傷ついた部分が菌糸体ディスクで完全に覆われていることを確認します。
- 菌糸体ディスクを滅菌湿らせた綿パッドで覆い、乾燥を防ぐ手段として。パッドをポリエチレンストリップでステムに結び付けて、接種ディスクの位置を維持します。
注:接種後8時間で、接種された穴は黒くなり、時間が経つにつれて病変が拡大しました。葉は黄色に変色して落ち、接種した植物は接種後7〜10日で死亡した。対照植物に病変は発生しなかった。ほとんどの遺伝子は、対照群と比較して 、Phytophthora capsici の接種後に異なって発現した。感染組織の組織病理学的分析は、 Phytophthora capsici が木部にコロニー形成したことを実証した。
- 目的の植物材料をサンプリングし、その後の研究で使用するために液体窒素中で-80°Cで保存します。
注:液体窒素、ビニール袋、マーカーペン、枝はさみ、およびその他の材料は、実験前に調製されました。 - 特定の植物材料が使用のためにサンプリングされた後、残りのすべての植物材料、残った Phytophthora capsici 培養および培養培地、ならびにこの接種作業で使用されるすべての器具および実験器具をオートクレーブで処理する。
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Representative Results
図1 は、 トウガラ シ菌接種後の黒コショウ葉の症状を示す。 図2 は、 トウガラ シ菌接種後の黒コショウ茎の症状を示す。病原体は基底茎の黒胡椒に感染した。葉の黄変、しおれの現れ、木部の褐変、血管の黒化などの症状が徐々に現れます。図3 は、 Phytophthora capsici の接種後に対照群と比較して異なる発現を示した遺伝子のほとんどを示す。 図4 は、感染組織の病理組織学的解析により木部にコロニー化した Phytophthora capsici を実証した。
図1: トウガラシ菌 接種後の黒胡椒葉の症状7. CK:制御群;接種:接種後。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2: トウガラシ菌 接種後の黒コショウ茎の症状7. 接種:接種後。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:黒胡椒の根における遺伝子の詳細な発現プロファイル。 図中のエラーバーは、3回の生物学的複製からの発現レベルの標準誤差を示す。X軸上のCK-8、CK-12、CK-24、CK-48、8、12、24、および48は、 P. capsiciとの接種後、対照上の8、12、24、および48時間、および8、12、24、および48時間を指す。y軸は、ユビキチンと比較した相対的発現量を表す。各列は、3つの生物学的複製物からの平均値にSD(標準偏差)を加えたものを表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:感染組織の病理組織学的解析 トルイジンブルーO単独染色(左カラム)とコットンブルーとサフラニンO二重染色(右カラム)との比較(20X)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この研究では、基底頭部をピンチで刺して損傷させ、黒胡椒植物に効果的な接種システムを提供しました。菌糸ペレットは、水分を保持し、病原体が植物によく感染できるように、3つの穴を覆った。接種後、葉は黄色に変色して脱落し、接種した植物は死んだ。対照植物に病変は発生しなかった。ほとんどの遺伝子は、対照群と比較して 、Phytophthora capsici の接種後に異なって発現した。真菌性疾患は、かなりの数の作物の構造的および生理学的障害の原因であり、生産者の生産性の低下および経済的損失につながる。真菌による植物組織の浸透およびコロニー形成の様式に関する組織学的技術を用いた構造的研究は、病原体と植物組織との間の相互作用の詳細な指標を提供する。これらの研究は、疾患の単環を理解するのに役立つ重要な側面を明らかにしました。感染組織の組織病理学的分析は、木部にコロニー形成した Phytophthora capsici を実証した。この方法は、土壌灌漑または根浸漬を含む伝統的な接種方法によって引き起こされる不安定性を解決するためのより良い手段を提供する。黒胡椒植物に対する Phytophthora capsici の効果的な接種と正確なサンプリングシステムは、この植物 - 病原体相互作用を研究するために不可欠です。また、農業精密育種における植物と他の土壌媒介性植物病原体との間の作用機序を研究するための有望な手段を提供する。
同時に、このプロトコルは、木質ブドウの孵化のための参照を提供するより効率的な方法を表しています。以前の研究では、病原体は、V8培地9で培養した胞子懸濁液で根浸漬することによって接種された。胞子懸濁液が準備されるまでに7日かかりますが、 Phytophthora capsici を培養するためのPDAの使用はわずか5日かかります。PDAプレートを、他の細菌や真菌からの汚染を避ける手段として透過性サージカルテープを用いて密封した。培養物を室温に保持した。この研究で使用された方法は、より多くの時間を節約し、より迅速に実施することができる。黒胡椒は糖分やフェノール類10を多く含む木質のつるで、 フィトフトラ・カプシチ が産生する遊走子は一般的に土壌中に発生するため、黒胡椒の蔓に感染しにくく、根11に感染不安定性を引き起こす。このプロトコルはより良い結果を提供し、ブドウ植物と土壌媒介病原体との間の強い相互作用を可能にする。植物と病原体の間の動的プロセスの検出は、目に見えて便利です。
灌漑ルート方法は速くて時間を節約しますが、黒コショウの問題は未解決のままです。Phytophthora capsiciは土壌媒介性病原体であり、一般に胞子嚢および遊走子を介して植物の根に感染する12。自然界では、胞子嚢は雨や灌漑によって広がることができます。遊走子が植物表面に付着すると、生殖管が植物組織に急速に発達して浸透し、感染をもたらす可能性がある13,14。これは、感染源として菌糸を選択することが胞子懸濁液に類似するという不確実性を引き起こす可能性があります。この研究で使用された方法は、黒胡椒植物の基礎頭をピンチして損傷を与えることから始まります。損傷した領域はPhytophthora capsiciで覆われ、水分が保持され、病原体が植物によく感染できることを保証します。この方法は、土壌灌漑または根浸漬を含む伝統的な接種方法によって引き起こされる不安定性を解決するのに優れている。また、農業精密育種における植物と他の土壌媒介性植物病原菌との間の作用機序を研究するための有望な方法である。
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Acknowledgments
この研究は、中国国家重点研究開発プログラム(2020YFD1001200)、中国農業研究システム(CARS-11)、海南省の学者のためのイノベーションプラットフォーム(YSPTZX202154)、中国海南省自然科学財団(321RC652)、中国自然科学財団(第31601626号)の財政的支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder | Solarbio | A8190 | |
| Clean bench | Haier | ||
| Dextrose | Xilong Scientific | 15700501 | |
| High temperature sterilizing oven | Zaelway | ||
| Petri dish plates | Biosharp | BS-90-D |
References
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