Summary
Denne biokjemiske rensemetoden med massespektrometribasert proteomisk analyse letter den robuste karakteriseringen av amyloidfibrilkjerner, noe som kan akselerere identifiseringen av mål for å forhindre Alzheimers sykdom.
Abstract
Proteinholdige fibrillar inneslutninger er viktige patologiske kjennetegn på flere nevrodegenerative sykdommer. I de tidlige stadiene av Alzheimers sykdom (AD) danner amyloid-beta peptider protofibrils i det ekstracellulære rommet, som fungerer som frø som gradvis vokser og modnes til store amyloidplakk. Til tross for denne grunnleggende forståelsen er dagens kunnskap om amyloidfibrilstrukturen, sammensetningen og avsetningsmønstrene i hjernen begrenset. En stor barriere har vært manglende evne til å isolere svært rensede amyloidfibriler fra hjerneekstrakter. Affinitetsrensing og laserfangst mikrodeseksjonsbaserte tilnærminger har tidligere blitt brukt til å isolere amyloider, men er begrenset av den lille mengden materiale som kan gjenvinnes. Denne nye, robuste protokollen beskriver biokjemisk rensing av amyloid plakkkjerner ved hjelp av natrium dodecylsulfat (SDS) solubilisering med sukrose tetthet gradient ultracentrifugation og ultralydbehandling og gir svært rene fibrils fra AD pasienter og AD modell hjernevev. Massespektrometri (MS)-basert bunn-opp proteomisk analyse av det rensede materialet representerer en robust strategi for å identifisere nesten alle de primære proteinkomponentene i amyloidfibriler. Tidligere proteomiske studier av proteiner i amyloid korona har avslørt en uventet stor og funksjonelt mangfoldig samling av proteiner. Spesielt, etter å ha raffinert rensestrategien, ble antall korensende proteiner redusert med mer enn 10 ganger, noe som indikerer den høye renheten til det isolerte SDS-uoppløselige materialet. Negativ farging og immuno-gull elektronmikroskopi tillot bekreftelse på renheten til disse preparatene. Videre studier er nødvendig for å forstå de romlige og biologiske egenskapene som bidrar til avsetning av disse proteinene til amyloid inneslutninger. Samlet sett er denne analytiske strategien godt posisjonert for å øke forståelsen av amyloidbiologi.
Introduction
Amyloid er et ekstremt stabilt supramolecular arrangement som finnes i et mangfoldig panel av proteiner, hvorav noen fører til patologiske endringer1. Akkumuleringen av intra- eller ekstracellulære amyloidaggregater observeres i flere nevrodegenerative sykdommer2. Amyloid aggregater er heterogene og er beriket med et stort antall proteiner og lipider3. De siste årene har interessen for amyloidproteom generert betydelig interesse blant grunnleggende og translasjonelle nevrologer. Flere metoder er utviklet for å trekke ut og rense amyloidaggregater fra mus og post-mortem humant hjernevev. Laserfangst mikrodeseksjon, immunoprecipitation, decellularisering og biokjemisk isolasjon av amyloidmengder er mye brukt metoder for å trekke ut og rense amyloidplakk, fibrils og oligomerer 4,5,6,7. Mange av disse studiene har fokusert på å bestemme proteinsammensetningen av disse tettpakkede fibrillaravsetningene ved hjelp av semi-kvantitativ MS. De tilgjengelige resultatene er imidlertid inkonsekvente, og det overraskende store antallet co-rensende proteiner som tidligere er rapportert, er utfordrende å tolke.
Den primære begrensningen i den eksisterende litteraturen som beskriver amyloidkjerneproteomet i AD- og AD-musemodellhjerner, er at det rensede materialet inneholder et uhåndterlig antall korensende proteiner. Det overordnede målet med denne metoden er å overvinne denne begrensningen og utvikle en robust biokjemisk rensing for å isolere amyloidfibrilkjerner. Denne strategien benytter en tidligere beskrevet sukrose tetthet gradient ultracentrifugation-basert biokjemisk metode for isolering av SDS uoppløselige beriket amyloid fraksjoner fra post-mortem AD human og mus hjernevev 8,9. Denne metoden bygger på den eksisterende litteraturen, men går videre med ultralydbehandling og SDS-vasker for å fjerne de fleste løst bundne amyloid-tilknyttede proteiner, noe som fører til isolering av svært rensede amyloidfibriler (figur 1). Fibrils renset av denne protokollen overvinne flere eksisterende utfordringer ofte møtt i strukturelle studier av amyloid fibrils isolert fra hjernen ekstrakter. Visualisering av disse fibrilene med transmisjonselektronmikroskopi (TEM) bekrefter integriteten og renheten til det rensede materialet (figur 2). I denne studien blir de isolerte fibrilene solubilisert og fordøyd til peptider med trypsin, og etikettfri MS-analyse kan lett avsløre identiteten til proteinene som danner fibrilkjernen. Spesielt har noen av disse proteinene en iboende tendens til å danne supramolekulære forsamlinger i ikke-membranbundne organeller. I tillegg er mange av proteinene identifisert i analysen av amyloid-beta (Aβ) fibrils også forbundet med andre nevrodegenerative sykdommer, noe som tyder på at disse proteinene kan spille en nøkkelrolle i flere proteinopatier.
Denne SDS / ultralydbehandlingsmetoden er usannsynlig å endre eller forstyrre strukturen til fibrilkjernene. Det rensede materialet er også egnet for et bredt spekter av ovenfra og ned og nedenfra-og-opp proteomiske analysetilnærminger og ytterligere MS-baserte strukturelle analysestrategier, for eksempel kjemisk krysskobling eller hydrogen-deuteriumutveksling. Den totale utvinningen ved hjelp av denne metoden er relativt høy og er derfor egnet for detaljerte strukturelle studier, som krever mikrogram til milligram av det rensede materialet. Det rensede materialet er også egnet for strukturelle studier ved hjelp av kryoEM og atomkraftmikroskopi. Denne protokollen, i kombinasjon med stabil isotopisk merking av pattedyr, kan lette solid-state kjernemagnetisk resonans (NMR) studier av amyloid struktur10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen innebærer bruk av humant eller virveldyr hjernevev. All forskning ble utført i samsvar med de godkjente institusjonelle retningslinjene til Northwestern University. Gjeldende arbeidsflyt er standardisert ved hjelp av APP-knock in (AppNL-G-F/NL-G-F) musehjerne kortikale og hippocampal hjerneregion ekstrakter11. Denne protokollen er optimalisert for hjerneekstrakter fra mus ved 6-9 måneders alder, og den kan effektivt rense amyloider fra både mannlige og kvinnelige dyr.
MERK: Hvis du vil ha en bedre forståelse av den generelle eksperimentelle prosedyren, kan du se figur 1 for å få et skjema i arbeidsflyten.
1. Vevshøsting og amyloidrensing
MERK: Ideelt sett bør amyloidfibriler isoleres fra ny dissekerte hjerneregioner. Imidlertid fungerer denne metoden også bra med snap- eller flash-frossen hjernevev. Nedenfor er en kort oversikt over snap-frysing hjernevev for lagring for bruk på et senere tidspunkt.
- Hjernevev høsting og lagring: Disseker musehjerner og høst raskt de amyloid-ladede områdene (dvs. cortex og hippocampus), etterfulgt av snapfrysing i flytende nitrogen eller et tørt isalkoholbad.
MERK: Snapfrysing bidrar til å bevare de strukturelle egenskapene til vevets bestanddeler. Musene er euthanized av isofluran og cervical dislokasjon12,13. Det anbefales å unngå å bruke CO2 siden det kan kompromittere hjernens proteomintegritet. - Etter disseksjon, kutt og oppbevar ferskt vev i små blokker (f.eks. 5 mm x 5 mm), da dette letter mer effektiv homogenisering før amyloidutvinning. Overfør vevet til det sterile kryogeniske hetteglasset, stram hetten og senk raskt.
- Hold vev frosset under ultrafargede forhold (dvs. -80 °C eller flytende nitrogen). Hvis ekstraksjon skal utføres noen dager senere, lagre vevet ved -20 °C og unngå fryse- og tinesykluser. Tine det frosne vevet på våt is når det er klart for utvinning og rensing.
MERK: Direkte kontakt av vevet med flytende nitrogen kan forårsake vevs- og proteinskader. Vær oppmerksom på at et alkoholbad kan fjerne permanente markører fra røretikettene.
2. Berikelse av SDS uoppløselig materiale
MERK: Utfør alle trinnene på is og sentrifuger ved 4 °C, med mindre annet er oppgitt. Detaljer om alle bufferne og løsningene som brukes i denne protokollen, finnes i tilleggsfil 1. Produsenter og katalognumre av kjemikalier og instrumenter er gitt i materialtabellen.
- Start med nyoppussede eller snapfrossen hjernevevsregioner (tint på is) plassert i et 2 ml rør som inneholder 6-8 keramiske perler og nylaget iskald homogeniseringsbuffer (1 ml for 0,25-1 g våt vevsmasse).
- Overfør rørene til perlemølle homogenisatoren og slip vevinnholdet ved 4000 rpm, med to sykluser på 30 s hver og et intervall på 30 s i mellom.
MERK: Alternativt kan motoriserte røre- eller homogenisatorsystemer brukes til å male og homogenisere vevet. - Tilsett 9 ml iskald homogeniseringsbuffer til 1 ml hjernevevshomogenat i 15 ml rør, tetning med laboratorievoksfilmstrimler og roter ende-til-ende over natten ved 4 °C for å sikre robust solubilisering.
MERK: For å fjerne uønsket store cellulære rusk og lipider, neste morgen, spinn rørene på 800 x g ved 4 °C i 10 minutter og samle supernatanten i et friskt rør. Resuspend den gjenværende pellet i 2 ml iskald homogenisering buffer, bland godt, spinn igjen i 10 min ved 4 °C, og kombiner de to supernatantene. - Tilsett langsomt fast sukrose til vevsekstraktfjæringen til en endelig konsentrasjon på 1,2 M, bland godt og sentrifuger ved 250.000 x g i 45 minutter ved 4 °C.
- Fjern og kast supernatanten forsiktig ved hjelp av en pipette. Resuspend pellet i 2 ml homogeniseringsbuffer som inneholder 1,9 M sukrose ved trianturering, etterfulgt av sentrifugering ved 125 000 x g i 45 minutter ved 4 °C.
MERK: Buffervolumet kan justeres basert på mengden materiale som ble gjenvunnet fra forrige trinn. Generelt er 10 volumer av homogeniseringsbuffer (V / V) ideell for dette trinnet. - Samle det øverste hvite faste laget ved hjelp av en pipette, overfør det til et friskt rør, og solubiliser i 1 ml iskald vaskebuffer ved å pipettere opp og ned flere ganger uten å introdusere luftbobler.
- Bortsett fra topplaget, er pellet også beriket med amyloidfibrils. For et høyere utbytte, kombiner de to fraksjonene og fortsett. Fjern forsiktig det midterste vandige laget ved hjelp av en pipette og kast.
- Sentrifuger de kombinerte fraksjonene ved 8000 x g i 20 min ved 4 °C. Kast supernatanten.
- Tilsett 1 ml iskald fordøyelsesbuffer til den vaskede pellet, resuspend og inkuber ved romtemperatur (RT) i 3 timer.
- Sentrifuge ved 8000 x g i 20 min ved 4 °C og fjern supernatanten ved hjelp av en pipette.
- Resuspend og vask (samme som trinn 2.8.) den fordøyde pelletsen to ganger i 1 ml iskald Tris-buffer.
- Resuspend den vaskede pellet i 1 ml solubiliseringsbuffer som inneholder 1% SDS og 1,3 M sukrose ved pipettering opp og ned. Sentrifuge raskt ved 200.000 x g i 60 min ved 4 °C.
MERK: Selv om amyloidfibrilene er svært motstandsdyktige mot vaskemidler og denaturer, kan svært lange eksponeringer for vaskemiddelet (1% SDS) påvirke integriteten til fibrilene eller fjerne de tettbundne proteinene, noe som vil kompromittere påfølgende analyser. Derfor, umiddelbart etter resuspending pellets, fortsett til sentrifugering. - Lagre pellet og øke volumet av gjenværende supernatant ved å legge til 50 mM Tris buffer (i forholdet 1:0.3) for å redusere sukrose konsentrasjonen fra 1,3 til 1 M og sentrifuge en gang til på 200,000 x g i 45 min ved 4 °C.
- Løs opp de to pelletsene i 100 μL Tris-buffer som inneholder 0,5% SDS og basseng for amyloid rensing. Synlige pellets er små og skal virke ugjennomsiktige og off-white (se figur 2A).
3. Amyloid rensing
MERK: Kombiner de to pelletsene, solubiliser ved pipettering til du får en jevn løsning og fortsett med følgende trinn for amyloidrensing.
- For fullstendig solubilisering av det amyloidrike materialet som finnes i pellets, underkast røret til mekanisk skjæring produsert av ultralydbølger i en bad sonikeringsenhet som kjører i 30 s PÅ og 30 s AV ved en mellomdistansefrekvens i 20 sykluser.
- Sentrifuger straks materialet ved 20.000 x g i 30 min ved 4 °C og resuspender pellet i 500 μL 0,5% SDS Tris buffer.
- Gjenta trinn 3.1. og trinn 3.2. fire ganger for totalt fem vasker. Antall vasker kan økes for å forbedre renheten.
MERK: Sonikerings- og vasketrinn optimaliseres ved 0,5 % SDS, da høyere konsentrasjoner kan påvirke strukturen, integriteten eller proteinsammensetningen til fibrilene. Det anbefales ikke å øke SDS-konsentrasjonen på dette trinnet. - Etter det siste sentrifugeringstrinnet, vask pelletsen i 200 μL ultra-rent vann og sentrifugering ved 20.000 x g i 30 minutter ved 4 °C for å fjerne eventuelt gjenværende vaskemiddel. Den vaskede pelletsen som inneholder rensede amyloidfibriler vises halvgjennomsiktig i fargen og er vanskelig å se noen ganger.
- Løs opp den endelige pelletsen som inneholder rensede amyloidfibriler i 100 μL ultrarent vann. Fortsett til neste trinn umiddelbart for nedstrøms behandling eller lagre fibril suspensjon ved -20 °C for videre analyse. Hvis frossen, tine på is før du starter nedbør.
4. Metanol kloroform nedbør
MERK: Hvis det endelige målet er å utføre proteinanalyse, anbefales det å avsalte og fjerne ytterligere ikke-proteinholdige urenheter.
- Tilsett 400 μL metanol til renset 100 μL amyloidfibrils i et 1,5 ml rør og virvelbrønn.
- Tilsett 100 μL kloroform til røret og virvelbrønnen.
- Tilsett 300 μL ultrarent vann og virvel grundig. Dette gjør blandingen overskyet på grunn av proteinutfelling.
- Sentrifuge ved 12 000 x g i 2 min ved RT.
- Fjern forsiktig det vandige laget (dvs. topp) uten å forstyrre grensesnittlaget som inneholder proteinflaket.
- Tilsett samme volum metanol igjen og sentrifuger på 12.000 x g i 2 min på RT.
- Kast supernatanten med en pipette og lufttørk pelletsen ved RT. Unngå overtørking; amyloidfraksjon er vanskelig å redissolve hvis overtørket.
5. Trypsin fordøyelse
- Løs opp pelletsen i 50 μL guanidinhydrokloridbuffer (GuHCl). Soniker i et iskaldt vannbad og varm ved 95 °C i 5 minutter, om nødvendig.
- Virvel grundig på RT i 45 min til 1 time for å oppløse den helt. Pellet vil ikke være synlig etter dette trinnet, og løsningen ser tydelig ut i utseende.
- Tilsett samme volum på 0,2% overflateaktiv løsning. Solubilize på RT med virvel i 60 min. Dette trinnet forbedrer trypsin enzymatisk aktivitet.
- Tilsett 1 μL tris-2-karboksyethylphosphine (TCEP) fra lagerløsningen på 500 mM. Inkuber i 60 min.
- Tilsett 2 μL 500 mM iodoacetamid (IAA) og inkuber i mørket i 20 minutter.
- Slukk IAA med 5 μL TCEP-oppløsning i 15 min.
- Tilsett det nødvendige volumet på 50 mM ammoniumbikarbonatoppløsning i røret for å redusere guanidinkonsentrasjonen til 1,5 M.
- Tilsett 1% overflateaktiv løsning på røret (1 μL / 50 μg protein).
- Tilsett trypsin (1 μg/100 μg protein) og la røret blandes ved 37 °C over natten.
6. Peptid opprydding
- Neste morgen, forsure den fordøyde peptidoppløsningen ved å senke pH til 2,0 ved å tilsette maursyre.
- Aktiver C18 (n-octadecyl) spinnkolonnen i et 2 ml mottakerrør ved å legge til 200 μL 50% metanoloppløsning og spinn på 1500 x g i 2 minutter ved RT. Gjenta aktiveringstrinnet.
- Likevekt C18 kolonne harpiks senger ved å legge 200 μL likevekt buffer og spinne i 2 min med samme forhold. Gjenta dette trinnet.
- Legg den surgjorte peptidløsningen på C18-kolonnen og sentrifugen ved 1500 x g i 2 minutter ved RT. Samle gjennomstrømningen og last den inn på nytt en gang til. Kast den andre gjennomstrømningen.
- Vask peptidene som er bundet til C18-harpiksen med vaskebufferen 2x, som gjort i trinn 6.3. Bruk samme likevektsbuffer for vasking av kolonnen.
- Elute peptidene ved å legge til 40 μL elutionbuffer etterfulgt av sentrifugering ved 1500 x g, i 2 min ved RT. Gjenta elutiontrinnet tre ganger for å øke utbyttet av de gjenvunne peptidene.
- Tørk peptidene i en hastighetsvakuumkonsentrator ved å fordampe den vandige løsningen. Tørre pellets kan lagres ved -20 °C i noen uker før MS-analysen.
7. Sette opp massespektrometer for peptidanalyse
MERK: For MS-parametere, se Tilleggsfil 1 (tilpasset fra en tidligere publikasjon fra laboratoriet)14.
- Før du laster inn peptidprøvene for MS-analysen, oppløs de tørre peptidpellets i 20 μL prøvelastebuffer og utfør mikro BCA for å kvantifisere konsentrasjonen av gjenvunnet peptider.
- Overfør oppløste peptider i et hetteglass i glass og last 3 μg (kvantifisert fra mikro BCA) peptider inn i UPLC-systemets autosampler.
- Last prøvene på en ventilert fellesøyle (C18 HPLC-kolonne, 0,075 mm x 20 mm) med en strømningshastighet på 250 nL/min.
- Ordne fellesøylen på linje med en analytisk kolonne (0,075 μm x 500 mm) og monter en senderspiss til elektrosprayioniseringskilden (ESI) utsatt for en sprøytespenning på 2000 V.
MERK: I denne studien utføres ESI, der den mobile fasen utsettes for høyspenningsionisering i gassfasen. Sprayen som er opprettet av dette, er rettet mot vakuumkammeret til MS gjennom en oppvarmet kapillær. Under vakuum oppstår avløsing av dråper og utkastelse av ioner i nærvær av varme og spenning. Deretter akselereres ionene mot masseanalysatoren i nærvær av et høyspenningsmiljø. - Analyser prøvene med 2 timers anskaffelseskjøringer. Denne studien utføres ved hjelp av dataavhengig oppkjøp med det mest intense topp 20 forløperionvalgsparadigmet.
MERK: Ved dataavhengig anskaffelse oppdages et begrenset antall forløperpeptider i MS1-skanningen og utsettes for fragmentering for MS2-analyse. Imidlertid er den dynamiske utelukkelsen problematisk her siden svært rikelig Aβ peptider vil bli utelatt for fragmentering og resultere i en undervurdering av mengden. - For absolutt kvantifisering av Aβ-peptider, kjør de samme prøvene en gang til ved hjelp av den målrettede MS/MS-metoden. For denne studien utarbeides en uttømmende liste over alle m/z-forhold for ulike mulige tryptiske Aβ-peptider for APP-knock-in-musemodellene (se supplerende tabell 1). Andre grupper bør utarbeide en lignende liste i samsvar med den tilgjengelige musemodellen og de mulige peptidene generert fra proteinet av interesse (f.eks. Aβ for AD).
MERK: For å håndtere utelukkelse av svært rikelig peptider, bruk en målrettet tilnærming ved å gi en liste over utvalgte m / z-verdier som tilsvarer Aβ-tryptiske peptider. Denne tilnærmingen løser problemet med dataavhengig utelukkelse av Aβ-peptider og kan kvantifisere de absolutte mengdene av forskjellige monomerer (Aβ38, 40 og 42 peptider) med høy oppløsning. - Massespektrometeret genererer MS-spektra av peptidprøvene og lagrer rådatafiler i målkatalogen. Bruk denne filen til å utføre spektral matching ved hjelp av veletablerte statistiske og bioinformatiske verktøy. Flere søke- og analyseverktøy for online og frakoblede databaser er tilgjengelige.
8. MS-dataanalyse
- Pakk ut MS1- og MS2-filene ved hjelp av det frakoblede Rawconverter-verktøyet (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/).
- Utføre identifikasjon, kvantifisering og detaljerte analyser av dataene på en nettbasert MS-datasøkemotor. I denne studien ble Integrated Proteomics Pipeline - IP2 (Bruker: http://www.integratedproteomics.com/) brukt.
MERK: Flere andre online og offline MS-dataanalyseverktøy er tilgjengelige og kan også brukes, for eksempel MaxQuant (https://www.maxquant.org/). - Når du har lastet opp MS1- og MS2-filene, velger du en oppdatert museproteomdatabase. Her velges en oppdatert musedatabase som inneholder flere app-knock-in spesifikke mutasjoner for identifisering av peptider ved hjelp av ProLuCId- og SEQUEST-algoritmer11.
- I IP2-analysesystemet velger du standardparametrene og endrer dem i henhold til de eksperimentelle kravene. I denne studien brukes en peptidmassetoleranse på 50 ppm for forløper og 600 ppm for fragmenter (se Tilleggsfil 1 for andre parametere som brukes i IP2).
MERK: Forskere kan endre søkeparametrene i samsvar med de eksperimentelle målene. For eksempel, for å identifisere post-translasjonelle modifikasjoner, legg til differensialendringsverdier for ulike PTMer (f.eks. allestedsnærværende, SUMMEROylering, fosforylering).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her oppsummeres en detaljert metode for isolering og rensing av amyloidfibriler ved hjelp av en modifisert sukrosetetthetsgradient ultrasentrifugation rensingsmetode (se figur 1). Innovasjonen i denne metoden er inkludering av trinn i ultralydbehandlingsbasert vask ved hjelp av et vannbad sonikeringssystem etterfulgt av SDS-solubilisering, som fjerner mange løst tilknyttede proteiner fra amyloidfibrilene som korenser med de svært tette og rene fibrilene. Ultralydstrinnet genererer en høy skjærekraft og agiterer fibrilene, løsner de hydrofobe kreftene og frigjør SDS løselig løst tilknyttede proteiner i SDS-vaskebufferen. I sin tur gjenvinnes små mengder svært rene amyloidfibrilkjerner. Som vist i figur 2A, kan en synlig pellet, som i utgangspunktet virker ugjennomsiktig (muligens på grunn av urenheter), ses etter berikelse; Men etter ultralydbehandling og flere SDS-vasker, blir pelletsen halvgjennomsiktig og er neppe synlig. Den representative kongorøde fargingen av rensede amyloider sammenlignet med SDS løselig brøkdel dokumenterer berikelsen av amyloidfibrilene (figur 2B). Kongo rød farging kan brukes til å bekrefte amyloidmaterialet i forskjellige fraksjoner og kan visualiseres ved hjelp av et lyst feltmikroskop. Som vist i figur 2C, flekker ikke SDS løselig brøkdel med Kongo rød fargestoff.
Strukturen til de rensede fibrilene med negativ fargingsoverføringselektronmikroskopianalyse bekreftet tilstedeværelsen av nesten rene amyloidfibriler (figur 2D). I tillegg bekreftet immunogoldmerking ved hjelp av en kombinasjon av Aβ42 (6E10 og 4G8) antistoffer tilstedeværelsen av Aβ42 peptider (figur 2E). For å undersøke sammensetningen og strukturelle egenskapene til det rensede materialet brukte vi immunoblotteknikker for Aβ-peptider og karakteristiske strukturelle signaturer (f.eks. fibrils). Representativ dot blot analyse av fraksjonene samlet under amyloid isolasjon viste en relativ overflod av Aβ42 peptider og fibrils ved hjelp av anti-Aβ42 og anti-fibril (LOC) antistoffer (Figur 3A). På samme måte viste den vestlige flekken av de representative fraksjonene også berikelse av Aβ42-inneholdende fibriler i proteiner med høy molekylvekt fanget i brønnene til SDS PAGE gel (figur 3B). For å forstå sammensetningen av disse høymolekylære fibrilene ble rensede amyloidfraksjoner utsatt for MS-basert proteomisk analyse. Disse semi-kvantitative resultatene avslørte tilstedeværelsen av ca. 250 proteiner, mens fraksjonen samlet før ultralydbehandling og SDS-vasker inneholdt mer enn 2500 proteiner (figur 3C). Dette indikerer effektiviteten av disse to viktige trinnene som er inkludert i denne renselsesprotokollen. Samlet sett indikerer flere uavhengige resultater den høye overfloden av lignende proteinklasser i fibrilkjerner.
Gen ontologi (GO) cellulær komponentanalyse for ett representativt MS-datasett i figur 4 viste at et stort antall proteiner tilstede i fibrilkjernene er forbundet med ikke-membranbundne organelle og supramolekulære komplekser. Denne observasjonen skyldes sannsynligvis den iboende tendensen til at mange proteiner aggregerer seg selv eller aggregerer seg sammen med andre proteiner i proteinholdige inneslutninger som er i nærheten. Fysiske krefter spiller avgjørende roller i disse interaksjonene. De andre cellulære organellene og komponentene som hovedsakelig er representert av disse proteinene, er mitokondrier, cytoskjelett, cellemembran og myelinhylse. Mange av disse proteinene samhandler med Aβ peptider, oligomerer eller protofibriler på forskjellige stadier av amyloiddannelse. De kan samhandle nær plasmamembranen, hvor Aβ peptider frigjøres. Samspillet kan også skje mens noen av disse proteinene frigjøres direkte eller via biltransport inn i det ekstracellulære rommet. Sekresjon eller eksocytose av proteinaggregater er en av mange strategier som celler bruker for å takle og redusere byrden forbundet med proteinmengder15. Dette etterlater en annen mulighet der noen av de intracellulære proteinene kan binde seg til Aβ-peptider. Protokollen gir et rammeverk for ytterligere optimalisering avhengig av eksperimentelle mål. For eksempel kan renheten og utbyttet, ved å endre antall ultralydbehandling og SDS-vasker, finjusteres tilsvarende.
Figur 1: En diagrammatisk oversikt over arbeidsflyten for isolering av amyloidfibrilskjerne fra AD post-mortem humant eller modelldyr hjernevev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bekreftelse av amyloidekstraksjon ved bruk av biokjemisk farging og avbildning av amyloidfibriler. (A) Beriket amyloidholdig SDS uoppløselig pellet fremstår ugjennomsiktig off-white i fargen. (B) Kongo rød farging av SDS løselig supernatant og SDS uoppløselig pellets som inneholder renset amyloid flekkete på 0,45 μm nitrocellulosemembran; BCA-avlesninger ble brukt til normalisering av lastmengden av proteinene. BCA-analyse ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. (C) Bright-field bilder av SDS løselig og amyloid materiale etter Kongo rød farging (skala bar: 100 μm). (D) Visualisering av SDS løselig brøkdel og rensede amyloidfibriler ved hjelp av negativ farging under elektronmikroskopet (skalastang: 100 nm). (E) Bekreftelse av Aβ42 peptider overflod i rensede amyloidfibriler ved immunogold elektronmikroskopi ved hjelp av Aβ42 (6E10 og 4G8) antistoffer (skala bar: 50 nm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Validering av amyloid rensing ved hjelp av immunoblot og MS-analyse. (A) Dot blot og (B) Vestlig blotanalyse av flere representative fraksjoner samlet inn under amyloidrensingsprosessen ved hjelp av anti-fibril LOC og anti-Aβ42 antistoff; BCA analyseavlesninger ble brukt til normalisering av lastmengden av proteinene. (C) Antall proteiner gjenvunnet i etikettfri massespektrometrianalyse av beriket og renset amyloidfraksjoner; micro BCA-analyse ble brukt til lasting av 3 μg fordøyde peptider for hver MS-analyse. BCA- og micro BCA-analyser ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Gen ontologi analyse av proteiner rikelig i rensede amyloidfraksjoner. (A) Cellulære komponenter og (B) KEGG-veier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Buffere og løsninger, massespektrometriparametere og ProLuCID-søkeparametere for identifisering av peptider. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 1 - En representativ liste over m / z-forhold identifisert i MS-kjøring for amyloid betapeptider av APP-bank i musemodeller. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Å utvikle en klar forståelse av amyloidstruktur og sammensetning er utfordrende for strukturbiologer og biokjemikere på grunn av de biologiske kompleksitetene og eksperimentelle begrensningene ved å trekke ut rensede fibriler fra AD-hjernevev16,17. Amyloid fibrils er polymorfiske på molekylært nivå, og viser en heterogen befolkning av varierende lengder og kompleksiteter18,19. For bedre å forstå deres biologiske egenskaper og patologiske relevans, er det nødvendig med en uttømmende karakterisering av sammensetningen av polymorfiske amyloidfibriler hentet fra post-mortem humant og AD-musehjernevev20,21. En stor undergruppe av proteiner samhandler direkte med Aβ42, mens andre kan ha en tendens til å danne store fibrillarstrukturer eller proteinkomplekser 22,23,24. Det er mer utfordrende å bestemme rollene som spilles av proteinene som samhandler med Aβ42 i amyloiddannelse, stabilisering og forlengelse når det gjelder AD-patologi. De siste årene har flere proteomiske studier belyst forskjellene og likhetene i proteinsammensetningen av ulike supramolecular ordninger, membranfrie organeller, inklusjonslegemer og proteinaggregater 25,26,27. I de tidlige stadiene av AD har flere cellulære proteiner (f.eks. Aβ42 og mikrotubule-assosiert tauprotein og apolipoprotein E) feilfoldet og samlet i flere hjerneregioner28,29. Amyloidogene proteinholdige formasjoner er et viktig patologisk kjennetegn ved AD og bidrar sannsynligvis til patogenese3.
Rensing av amyloid fibrils fra syke menneskelige hjerner er en kjedelig og utfordrende oppgave og har flere begrensninger. En stor ulempe ved de eksisterende metodene er den lave renheten av ekstrahert materiale, som ofte begrenser deres detaljerte strukturelle analyse ved hjelp av avbildningsmetoder, for eksempel cryoEM. På samme måte krever NMR-studier noen få milligram renset materiale, som også må merkes med tunge isotoper (dvs. 15N)30. Post-mortem menneskelige hjerner kan oppfylle det første kravet, da startmaterialet kan økes opp til noen få gram menneskelig vev; Det er imidlertid ikke mulig å merke menneskelig hjernevev med tunge isotoper. På den annen side er merking av AD-musemodellene med 15N isotoper mulig (selv om det er kostbart) og blir nå stadig vanligere31,32. Laboratoriet vårt har brukt pulsjaktmerking for å studere synaptisk proteinomsetningsdynamikk under sykdom og aldrende hjerner14. Vi har også brukt heldyr tung isotopmerking for å identifisere langvarige proteiner og forstå deres fysiologiske relevans i forseggjorte biologiske strukturer33,34. Men for musehjernen er det nødvendig med store mengder startmateriale for å oppnå en brukbar mengde av fibrilkjernene. Denne metoden løser disse problemene ved å forbedre utbyttet og renheten til de ekstraherte amyloidfibrilene ved å endre de eksisterende biokjemiske isolasjonsprinsippene. Derfor kan denne robuste protokollen for amyloid fibrils ekstraksjon fra hjernevev lett brukes til kryoEM og NMR-baserte strukturelle studier.
Denne metoden benytter det eksisterende sukrosetetthetsgradientbaserte subcellulære fraksjoneringsparadigmet og fjerner ikke-spesifikke korensende proteiner i etterfølgende trinn. Etter fjerning av celleavfall, myelin, DNA og cellulære lipider, isoleres de amyloidrike SDS-uoppløselige pelletsene. Inkorporering av flere trinn i flere ultralydbehandlingskoblede SDS-vasker bidrar til å redusere antall korensende cellulære komponenter, løst bundet proteiner og mindre SDS løselige polymorfer av amyloider. Den endelige pelletsen er solubilisert i ultrarent vann og kan brukes til mange bruksområder, inkludert såingsforsøk, biokjemiske eller farmakologiske studier og strukturell analyse. De rensede amyloidfibrilene fra AD-hjernevev brukes også til å forstå den proteomiske sammensetningen og strukturelle egenskapene til fibrilkjerner ved hjelp av MS-basert proteomikk. Denne analysen bekreftet tilstedeværelsen av en undergruppe av cellulære proteiner (representert i figur 4) i kjernen av fibrilene, noe som kan indikere de mulige rollene til mer enn ett protein i dannelsen, forlengelsen og stabiliseringen av amyloidfibriler over lang tid. Noen av proteinene identifisert i denne analysen er kjent for sin tilknytning til mer enn en nevrodegenerativ lidelse, for eksempel Adam22, APP, ApoE, β-catenin neurofilamentproteiner, 14-3-3 proteiner og andre.
Det er muligheter for at noen forurensende proteiner kan oppstå i proteomisk analyse på grunn av det faktum at etter homogenisering kan noen uberettigede interaksjoner skje blant proteiner på grunn av den høye hydrofobiske amyloidfibrilene. Noen av disse proteinene holder seg til kjernene og fjernes ikke selv etter flere runder med sonikering og SDS-vasketrinn. Dette er en begrensning av denne amyloid rensing strategien. Det kan imidlertid løses ved hjelp av egnede negative kontroller og utføre effektive statistiske avskjæringer i store proteomiske studier. En annen begrensning som vi opplevde er knyttet til underestimering av Aβ peptid overflod etter trypsin fordøyelse. Dette er adressert i denne arbeidsflyten av en målrettet MS/MS-analysestrategi. GO-analyse for KEGG-veier indikerer overflod av proteiner som tilhører veier involvert i mange nevrodegenerative sykdommer, for eksempel Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Prion sykdommer. Disse proteinene er viktige aktører i flere patologiske veier og har dermed kjent involvering i sykdomsinitiering og progresjon. Interessant nok krever noen av disse proteinene ytterligere analyse for å bestemme deres mulige involvering i patologien til AD og andre nevrodegenerative sykdommer.
Fremtidige studier på rent amyloidmateriale fra andre sykdomsmodeller kan gi en grundig forståelse av de strukturelle mønstrene og sammensetningen av kjernefibriler og kan bidra til å identifisere viktige terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH grant R01AG061865 til R.J.V. og J.N.S. Forfatterne takker Vassar og Savas forskningsgruppemedlemmer ved Northwestern University for deres gjennomtenkte diskusjoner. Vi takker også oppriktig Dr(s). Ansgar Seimer og Ralf Langen ved University of South California for deres avgjørende innspill. Vi takker Dr. Farida Korabova for prøvepreparering og negativ farging elektronmikroskopiavbildning ved Northwestern University Center for Advanced Microscopy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline - IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
References
- Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
- Rambaran, R. N., Serpell, L. C.
- Upadhyay, A., et al. Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges. The Neuroscientist. , (2021).
- Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils. PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).
- Kourelis, T. V., et al. A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques. JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).
- Mangione, P. P., et al. Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies. Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).
- Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis. Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).
- Roher, A. E., et al. Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).
- Lu, J. -X., et al. Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue. Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).
- Tycko, R. Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).
- Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).
- Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).
- Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. Li, K. 57, Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
- Hark, T. J., et al. Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals. Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).
- Liu, S., et al. Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions. Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).
- Toyama, B. H., Weissman, J. S. Amyloid structure: conformational diversity and consequences. Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).
- Sundaria, N., et al. Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges. Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).
- Cendrowska, U., et al. Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).
- Seuring, C., et al. Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).
- Close, W., et al. Physical basis of amyloid fibril polymorphism. Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).
- Tycko, R. Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).
- Konstantoulea, K., et al. Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure. The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).
- Hondius, D. C., et al. Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).
- Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).
- Hosp, F., et al. Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function. Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).
- Wallace, E. W. J., et al. Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress. Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).
- Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles. Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).
- Kepchia, D., et al. Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain. Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).
- Espay, A. J., et al. Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases. Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).
- Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. Recent progress in understanding Alzheimer's β-amyloid structures. Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).
- Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).
- Michno, W., et al. Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics. Science Advances. 7 (25), (2021).
- Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
- Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).
