Het fabriceren van zeer open poreuze microsferen (HOPM's) via microfluïdische technologie
Summary
Het huidige protocol beschrijft de fabricage van op poly (melkzuur-co-glycolzuur) gebaseerde zeer open poreuze microsferen (HOPM’s) via de op single-emulsieformulering gebaseerde facile microfluïdische technologie. Deze microsferen hebben potentiële toepassingen in tissue engineering en drugsscreening.
Abstract
Vergeleken met bulksteigers en directe injectie van cellen alleen, hebben de injecteerbare modulaire eenheden enorme interesse gewekt in het repareren van slecht functionerende weefsels vanwege het gemak in de verpakking van cellen, verbeterde celretentie en minimale invasiviteit. Bovendien zou de poreuze conformatie van deze microschaaldragers de mediumuitwisseling kunnen verbeteren en het niveau van voedingsstoffen en zuurstofvoorraden kunnen verbeteren. De huidige studie illustreert de handige fabricage van poly (melkzuur-co-glycolzuur) -gebaseerde zeer open poreuze microsferen (PLGA-HOPMs) door de gemakkelijke microfluïdische technologie voor celafgiftetoepassingen. De resulterende monodispersed PLGA-HOPMs bezaten deeltjesgroottes van ~ 400 μm en open poriën van ~ 50 μm met onderling verbonden vensters. In het kort werden de geëmulgeerde oliedruppels (PLGA-oplossing in dichloormethaan, DCM), omwikkeld met de 7,5% (w /v) gelatine waterige fase, geïntroduceerd in de 1% (w / v) continu stromende poly (vinylalcohol) (PVA) waterige oplossing door het coaxiale mondstuk in de aangepaste microfluïdische opstelling. Vervolgens werden de microsferen onderworpen aan oplosmiddelextractie en lyofilisatieprocedures, wat resulteerde in de productie van HOPM’s. Met name verschillende formuleringen (concentraties van PLGA en porogeen) en verwerkingsparameters (emulgerende kracht, naaldmeter en stroomsnelheid van gedispergeerde fase) spelen een cruciale rol in de kwaliteiten en kenmerken van de resulterende PLGA HOPMs. Bovendien kunnen deze architecturen mogelijk verschillende andere biochemische signalen inkapselen, zoals groeifactoren, voor uitgebreide medicijnontdekking en weefselregeneratietoepassingen.
Introduction
Celbeladen microsferen bieden gunstige voordelen, zoals verbeterde celretentiecapaciteit in situ, efficiënte levering van cellen en het daaropvolgende vermogen van celproliferatie in vivo1. Tot op heden zijn tal van onderzoeken naar voren gebracht voor het ontwikkelen van een succesvolle steigerstructuur ter ondersteuning van een gunstige omgeving voor cellen voor weefselregeneratie of medicijnscreeningtoepassingen2. De hypoxieomgeving is echter vaak onvermijdelijk in het interieur vanwege onvoldoende toevoer van voedingsstoffen / zuurstof en metabole afvalophoping3. Om deze problemen te overwinnen, zijn zeer poreuze microsferen (PM’s) ontwikkeld met behulp van verschillende biomaterialen 4,5,6. Bovendien lijden de steigers in dynamische cultuur aan overmatige schuifspanning7 en kan de onstabiele toestand van het kweekmedium de betrouwbaarheid van PM’s verbreken. Als alternatief kan poly (melk-co-glycolzuur) (PLGA) worden gebruikt om PM’s met een goede mechanische sterkte voor dynamische cultuur te verwerken1. We toonden bijvoorbeeld co-injectie van muismyoblast (C2C12)-beladen PLGA zeer open PM’s (HOPM’s) en menselijke navelstrengatheliale cel (HUVEC)-beladen poly (ethyleenglycol) holle microstaafjes om volumetrisch spierverlies te genezen, waardoor een opmerkelijke verbetering van in situ skeletspierregeneratiewordt bereikt 8.
Met name PM’s worden gekenmerkt door grote oppervlakten en hoge porositeiten, wat van specifiek belang is voor celadhesie en groei naar minimaal invasieve celafgifte9. Met het oog op deze aspecten zijn verschillende biocompatibele materialen gebruikt om de PM’s10,11 te fabriceren. Deze ontwerpbare PM’s gecocultureerd met cellen bieden een uitstekende hechting, aanzienlijke mechanische sterkte en sterk onderling verbonden vensters, die de celproliferatie voor het repareren van beschadigde weefsels kunnen verbeteren12. In dit verband zijn ook verschillende technologieën ontwikkeld om poreuze bollen te fabriceren13,14. Aan de ene kant werden PM’s geproduceerd met behulp van gasvormende middelen, zoals NH4HCO3, die werden beperkt vanwege onvoldoende interconnectiviteit 15,16,17. Aan de andere kant werden PM’s direct geschoren na emulgering, wat leidde tot polydisperse PM’s18. Uiteindelijk is de druppelmicrofluïdische technologie op basis van de emulsie-templatingbenadering misschien een efficiënte methode voor het construeren van PM’s, omdat het vaak resulteert in deeltjes van uniforme grootte19. Met name de morfologische eigenschappen van de microsferen zijn vaak afhankelijk van de kwaliteit van de gegenereerde emulsiedruppels (d.w.z. water-in-olie, W / O of olie-in-water, O / W), die de kenmerken van de biomaterialen aanzienlijk kunnen beïnvloeden20. Het is vermeldenswaard dat het vooraf ontworpen microfluïdische platform kan worden toegepast om de microvezels of microsferen te genereren. In een geval toonden Yu et al. de productie aan van met cellen beladen microfibrousstructuren op basis van capillaire microfluïdische platforms, die kunnen worden gebruikt om cellulaire netwerken samen te stellen voor het nabootsen van natuurlijke weefsels21. In een ander geval fabriceerden Ye et al. fotonische kristalmicrocapsules door de sjabloonreplicatie van silica colloïdale kristalparels door middel van microfluïdische technologieën, die veel beperkingen van de huidige technieken die complexe etikettering en specifieke apparatuur vereisen, zouden kunnen overwinnen22.
Inderdaad, de redenering achter het gebruik van deze techniek is te wijten aan verschillende voordelen, zoals gemakkelijk van aard zijn, geen geavanceerde apparatuur vereisen, en het gemak ervan bij het synthetiseren van PM’s van uniforme grootte voor celafgifte en regeneratieve geneeskundetoepassingen. In deze context kunnen PM’s met hoge porositeiten en interconnectiviteit met vooraf opnieuw ontworpen componenten van emulsie-templating gemakkelijk worden verkregen uit een microfluïdisch apparaat dat is samengesteld uit poly (vinylchloride) (PVC) buizen, een glazen capillair en een naald. Een W/O-emulsie-precursor wordt bereid door een waterige oplossing van gelatine en een organische oplossing van PLGA te homogeniseren. Door selectief het toepasselijke deel van de emulsie in het microfluïdische platform te injecteren, worden de PM’s met uniforme deeltjesgroottes en onderling verbonden poriën over het hele oppervlak naar het binnenste vervaardigd. Het huidige protocol heeft tot doel de PLGA-HOPM’s te fabriceren door emulsie-templating in het microfluïdische platform. Er wordt aangenomen dat dit protocol reproduceerbare productie van PLGA-HOPM’s mogelijk maakt en mogelijk toepasbaar zal zijn op hun gerelateerde gebieden van tissue engineering en geneesmiddelenscreening.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft een efficiënte strategie om PLGA-gebaseerde architecturen te fabriceren, namelijk de PLGA-HOPMs. Opgemerkt moet worden dat verschillende kritieke stappen zorgvuldig moeten worden genomen, waaronder het vermijden van oplosmiddelvervluchtiging van PLGA en een zachte aanpassing van het ultrasone vermogen aan de doelpositie tijdens de voorbereiding van de emulsie. Bovendien kan de vloeistofuitlaat van de spuit van 20 ml tot op zekere hoogte worden aangepast om de fasescheiding van geëmulgeerde precur…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SCL, YW, RKK en AZC erkennen financiële steun van de National Natural Science Foundation of China (NSFC, 32071323, 81971734 en U1605225) en het Programma voor innovatief onderzoeksteam in wetenschap en technologie aan de Fujian Province University. YSZ werd niet ondersteund door een van deze programma’s en ontving geen betaling van welke aard dan ook; in plaats daarvan wordt de steun van het Brigham Research Institute erkend.
Materials
| Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
| Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
| Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
| DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
| Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
| Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
| Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
| Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
| Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
| Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
| Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
| Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
| PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
| Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
| Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
| Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
| Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
| Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
| Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
| UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |
References
- Kankala, R. K., et al. Highly porous microcarriers for minimally invasive in situ skeletal muscle cell delivery. Small. 15 (25), 1901397 (2019).
- Wang, Y., et al. Modeling endothelialized hepatic tumor microtissues for drug screening. Advanced Science. 7 (21), 2002002 (2020).
- Li, Q., et al. Tripeptide-based macroporous hydrogel improves the osteogenic microenvironment of stem cells. Journal of Materials Chemistry B. 9 (30), 6056-6067 (2021).
- Liu, Y., et al. PLGA hybrid porous microspheres as human periodontal ligament stem cell delivery carriers for periodontal regeneration. Chemical Engineering Journal. 420, 129703 (2021).
- Wei, P., Xu, Y., Zhang, H., Wang, L. Continued sustained insulin-releasing PLGA nanoparticles modified 3D-printed PCL composite scaffolds for osteochondral repair. Chemical Engineering Journal. 422, 130051 (2021).
- Sang, S., et al. Biocompatible chitosan/polyethylene glycol/multi-walled carbon nanotube composite scaffolds for neural tissue engineering. Journal of Zhejiang University-Science B. 23 (1), 58-73 (2022).
- Ghasemian, M., et al. Hydrodynamic characterization within a spinner flask and a rotary wall vessel for stem cell culture. Biochemical Engineering Journal. 157, 107533 (2020).
- Wang, Y., et al. Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration. Biomaterials. 277, 121072 (2021).
- Kang, S. W., Bae, Y. H. Cryopreservable and tumorigenic three-dimensional tumor culture in porous poly(lactic-co-glycolic acid) microsphere. Biomaterials. 30 (25), 4227-4232 (2009).
- Fan, D., et al. Mesoporous silicon-PLGA composite microspheres for the double controlled release of biomolecules for orthopedic tissue Engineering. Advanced Functional Materials. 22 (2), 282-293 (2012).
- Xu, Y., et al. Metabolism balance regulation via antagonist-functionalized injectable microsphere for nucleus pulposus regeneration. Advanced Functional Materials. 30 (52), 2006333 (2020).
- Yao, R., Zhang, R., Lin, F., Luan, J. Injectable cell/hydrogel microspheres induce the formation of fat lobule-like microtissues and vascularized adipose tissue regeneration. Biofabrication. 4 (4), 045003 (2012).
- Sikavitsas, V. I., Bancroft, G. N., Mikos, A. G. Formation of three-dimensional cell/polymer constructs for bone tissue engineering in a spinner flask and a rotating wall vessel bioreactor. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (1), 136-148 (2002).
- Kim, T. K., Yoon, J. J., Lee, D. S., Park, T. G. Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres. Biomaterials. 27 (2), 152-159 (2006).
- Wang, C. Y., Liao, H. F., Sheu, D. C. Enhancement of recombinant human macrophage colony-stimulating factor production using culture systems with porous polymeric microspheres. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 41 (2), 203-208 (2010).
- Amoyav, B., Benny, O. Microfluidic based fabrication and characterization of highly porous polymeric microspheres. Polymers. 11 (3), 419 (2019).
- Zhang, H., et al. Microfluidic fabrication of inhalable large porous microspheres loaded with H2S-releasing aspirin derivative for pulmonary arterial hypertension therapy. Journal of Controlled Release. 329, 286-298 (2021).
- Qu, M., et al. Injectable open-porous PLGA microspheres as cell carriers for cartilage regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 109 (11), 2091-2100 (2021).
- Zheng, Y., et al. Microfluidic droplet-based functional materials for cell manipulation. Lab on a Chip. 21 (22), 4311-4329 (2021).
- Kawakatsu, T., Kikuchi, Y., Nakajima, M. Regular-sized cell creation in microchannel emulsification by visual microprocessing method. Journal of the American Oil Chemists’ Society. 74 (3), 317-321 (1997).
- Yu, Y., Shang, L., Guo, J., Wang, J., Zhao, Y. Design of capillary microfluidics for spinning cell-laden microfibers. Nature Protocols. 13 (11), 2557-2579 (2018).
- Ye, B., et al. Photonic crystal microcapsules for label-free multiplex detection. Advanced Materials. 26 (20), 3270-3274 (2014).
- Zhong, Z., et al. Zn/Sr dual ions-collagen co-assembly hydroxyapatite enhances bone regeneration through procedural osteo-immunomodulation and osteogenesis. Bioactive Materials. 10, 195-206 (2022).
- Poole, C. A., Brookes, N. H., Clover, G. M. Keratocyte networks visualized in the living cornea using vital dyes. Journal of Cell Science. 106 (2), 685-692 (1993).
- Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An overview of poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 3640-3659 (2014).
- Lanao, R. P. F., et al. Physicochemical properties and applications of Poly(lactic-co-glycolic acid) for use in bone regeneration. Tissue Engineering Part B-Reviews. 19 (4), 380-390 (2013).
