Mikroakışkan Teknoloji ile Yüksek Açık Gözenekli Mikrosferlerin ( HOPM'ler ) Üretilmesi
Summary
Bu protokol, tek emülsiyon formülasyonuna dayalı kolay mikroakışkan teknolojisi ile poli(laktik-ko-glikolik asit) bazlı yüksek açık gözenekli mikrosferlerin (HOPM’ler) üretimini açıklamaktadır. Bu mikrosferlerin doku mühendisliği ve ilaç taramasında potansiyel uygulamaları vardır.
Abstract
Toplu iskeleler ve tek başına hücrelerin doğrudan enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında, enjekte edilebilir modüler üniteler, hücrelerin paketlenmesindeki kolaylık, gelişmiş hücre tutma ve minimum invazivlik nedeniyle arızalı dokuların onarımında büyük ilgi görmüştür. Dahası, bu mikro ölçekli taşıyıcıların gözenekli konformasyonu, orta değişimi artırabilir ve besin ve oksijen kaynaklarının seviyesini artırabilir. Bu çalışma, hücre dağıtım uygulamaları için kolay mikroakışkan teknolojisi ile poli(laktik-ko-glikolik asit) bazlı yüksek açık gözenekli mikrosferlerin (PLGA-HOPM’ler) uygun şekilde üretilmesini göstermektedir. Ortaya çıkan monodispers PLGA-HOPM’lar, ~400 μm’lik parçacık boyutlarına ve birbirine bağlı pencerelerle ~50 μm’lik açık gözeneklere sahipti. Kısaca,% 7.5 (w / v) jelatin sulu faz ile sarılmış emülsifiye yağ damlacıkları (diklorometan, DCM’deki PLGA çözeltisi), özelleştirilmiş mikroakışkan kurulumdaki koaksiyel nozul aracılığıyla% 1 (w / v) sürekli akan poli (vinil alkol) (PVA) sulu çözeltiye sokulmuştur. Daha sonra, mikrosferler çözücü ekstraksiyonu ve liyofilizasyon prosedürlerine tabi tutuldu ve bu da HOPM’lerin üretilmesiyle sonuçlandı. Özellikle, çeşitli formülasyonlar (PLGA ve porojen konsantrasyonları) ve işleme parametreleri (emülsifiye edici güç, iğne göstergesi ve dağınık fazın akış hızı), ortaya çıkan PLGA HOPM’ların niteliklerinde ve özelliklerinde çok önemli roller oynamaktadır. Dahası, bu mimariler, genişletilmiş ilaç keşfi ve doku rejenerasyonu uygulamaları için büyüme faktörleri gibi çeşitli diğer biyokimyasal ipuçlarını potansiyel olarak kapsülleyebilir.
Introduction
Hücre yüklü mikrosferler, in situ hücre tutma kapasitesinin artması, hücrelerin verimli bir şekilde verilmesi ve ardından in vivo1 hücre çoğalmasının kabiliyeti gibi olumlu avantajlar sunar. Bugüne kadar, doku rejenerasyonu veya ilaç tarama uygulamaları için hücreler için elverişli bir ortamı desteklemek üzere başarılı bir iskele yapısı geliştirmek için çok sayıda araştırma yapılmıştır2. Bununla birlikte, hipoksi ortamı, yetersiz besin / oksijen kaynağı ve metabolik atık birikimi nedeniyle iç mekanlarda çoğu zaman kaçınılmazdır3. Bu sorunların üstesinden gelmek için, çeşitli biyomalzemeler kullanılarak yüksek gözenekli mikrosferler (PM’ler) geliştirilmiştir 4,5,6. Ek olarak, dinamik kültürde, iskeleler aşırı kesme gerilmesi7’den muzdariptir ve kültür ortamının dengesiz durumu PM’lerin doğruluğunu bozabilir. Alternatif olarak, dinamik kültür1 için iyi mekanik mukavemete sahip PM’leri işlemek için poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) kullanılabilir. Örneğin, hacimsel kas kaybını iyileştirmek için fare miyoblastı (C2C12) yüklü PLGA yüksek derecede açık PM’ler (HOPM’ler) ve insan göbek damarı endotel hücresi (HUVEC) yüklü poli (etilen glikol) içi boş mikroçubukların birlikte enjeksiyonunu gösterdik ve in situ iskelet kası rejenerasyonunda kayda değer bir iyileşme sağladık8.
Özellikle, PM’ler geniş yüzey alanları ve yüksek gözeneklilikler ile karakterizedir, bu da minimal invaziv hücre dağıtımına yönelik hücre yapışması ve büyümesi için özel bir ilgi alanıdır9. Bu hususlar ışığında, PMs10,11’in imalatında çeşitli biyouyumlu malzemeler kullanılmıştır. Hücrelerle birlikte kültürlenmiş bu tasarlanabilir PM’ler, hasarlı dokuların onarımı için hücre proliferasyonunu artırabilecek mükemmel yapışma, önemli mekanik mukavemet ve yüksek oranda birbirine bağlı pencereler sunar12. Bu bağlamda, gözenekli küreleri imal etmek için çeşitli teknolojiler de geliştirilmiştir13,14. Bir yandan, PM’ler, yetersiz ara bağlantı15,16,17 nedeniyle kısıtlanan NH4HCO3 gibi gaz oluşturucu ajanlar kullanılarak üretildi. Öte yandan, PM’ler emülsifikasyondan sonra doğrudan kesildi ve bu da PM’lerin18’ini polidisperse etmesine yol açtı. Sonunda, emülsiyon-şablonlama yaklaşımına dayanan damlacık mikroakışkan teknolojisi, PM’leri oluşturmak için belki de etkili bir yöntemdir, çünkü genellikle tek tip boyutlu parçacıklar19 ile sonuçlanır. Özellikle, mikrosferlerin morfolojik özellikleri genellikle üretilen emülsiyon damlacıklarının kalitesine bağlıdır (yani, yağda su, W / O veya su içinde yağ, O / W), bu da biyomalzemelerin özelliklerini önemli ölçüde etkileyebilir20. Önceden tasarlanmış mikroakışkan platformun mikrofiberleri veya mikrosferleri üretmek için uygulanabileceğini belirtmek gerekir. Bir örnekte, Yu ve ark., doğal dokuları taklit etmek için hücresel ağları bir araya getirmek için kullanılabilecek kılcal bazlı mikroakışkan platformlara dayanan hücre yüklü mikrofibröz yapıların üretimini göstermiştir21. Başka bir örnekte, Ye ve ark. silika kolloidal kristal boncukların mikroakışkan teknolojiler aracılığıyla şablon replikasyonu ile fotonik kristal mikrokapsüller ürettiler, bu da karmaşık etiketleme ve spesifik aparat gerektiren mevcut tekniklerin birçok sınırlamasının üstesinden gelebilir22.
Gerçekten de, bu tekniğin kullanılmasının ardındaki mantık, doğada kolay olması, sofistike ekipman gerektirmemesi ve hücre dağıtımı ve rejeneratif tıp uygulamaları için tek tip boyutlu PM’lerin sentezlenmesindeki kolaylık gibi çeşitli avantajlardan kaynaklanmaktadır. Bu bağlamda, emülsiyon-şablonlamanın önceden tasarlanmış bileşenleri ile, yüksek gözenekliliğe ve birbirine bağlanabilirliğe sahip PM’ler, poli(vinil klorür) (PVC) borudan, bir cam kılcal damardan ve bir iğneden monte edilmiş mikroakışkan bir cihazdan kolayca elde edilebilir. Bir W/O emülsiyon öncüsü, sulu bir jelatin çözeltisi ve organik bir PLGA çözeltisi homojenize edilerek hazırlanır. Emülsiyonun uygulanabilir kısmını seçici olarak mikroakışkan platforma enjekte ederek, homojen partikül boyutlarına ve yüzey boyunca iç mekana birbirine bağlı gözeneklere sahip PM’ler üretilir. Mevcut protokol, PLGA-HOPM’ları mikroakışkan platformda emülsiyon-şablonlama ile üretmeyi amaçlamaktadır. Bu protokolün PLGA-HOPM’ların tekrarlanabilir üretimine izin verdiğine ve potansiyel olarak ilgili doku mühendisliği ve ilaç tarama alanlarında uygulanabilir olacağına inanılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, PLGA-HOPM’ler gibi PLGA tabanlı mimariler üretmek için etkili bir strateji açıklanmaktadır. PLGA’nın çözücü uçuculuğundan kaçınmak ve emülsiyonun hazırlanması sırasında ultrasonik gücün hedef konuma nazikçe ayarlanması da dahil olmak üzere birkaç kritik adımın dikkatlice atılması gerektiğine dikkat edilmelidir. Ek olarak, 20 mL şırınganın sıvı çıkışı, emülsifiye öncüllerin faz ayrımını çözmek için belirli bir dereceye kadar ayarlanabilir. Bununla birlikte, b…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SCL, YW, RKK ve AZC, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’ndan (NSFC, 32071323, 81971734 ve U1605225) ve Fujian Eyalet Üniversitesi’ndeki Bilim ve Teknoloji Yenilikçi Araştırma Ekibi Programı’ndan finansal desteği kabul eder. YSZ ne bu programlardan herhangi biri tarafından desteklendi ne de herhangi bir türde ödeme aldı; bunun yerine, Brigham Araştırma Enstitüsü’nün desteği kabul edilmektedir.
Materials
| Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
| Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
| Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
| DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
| Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
| Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
| Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
| Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
| Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
| Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
| Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
| Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
| PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
| Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
| Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
| Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
| Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
| Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
| Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
| UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |
References
- Kankala, R. K., et al. Highly porous microcarriers for minimally invasive in situ skeletal muscle cell delivery. Small. 15 (25), 1901397 (2019).
- Wang, Y., et al. Modeling endothelialized hepatic tumor microtissues for drug screening. Advanced Science. 7 (21), 2002002 (2020).
- Li, Q., et al. Tripeptide-based macroporous hydrogel improves the osteogenic microenvironment of stem cells. Journal of Materials Chemistry B. 9 (30), 6056-6067 (2021).
- Liu, Y., et al. PLGA hybrid porous microspheres as human periodontal ligament stem cell delivery carriers for periodontal regeneration. Chemical Engineering Journal. 420, 129703 (2021).
- Wei, P., Xu, Y., Zhang, H., Wang, L. Continued sustained insulin-releasing PLGA nanoparticles modified 3D-printed PCL composite scaffolds for osteochondral repair. Chemical Engineering Journal. 422, 130051 (2021).
- Sang, S., et al. Biocompatible chitosan/polyethylene glycol/multi-walled carbon nanotube composite scaffolds for neural tissue engineering. Journal of Zhejiang University-Science B. 23 (1), 58-73 (2022).
- Ghasemian, M., et al. Hydrodynamic characterization within a spinner flask and a rotary wall vessel for stem cell culture. Biochemical Engineering Journal. 157, 107533 (2020).
- Wang, Y., et al. Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration. Biomaterials. 277, 121072 (2021).
- Kang, S. W., Bae, Y. H. Cryopreservable and tumorigenic three-dimensional tumor culture in porous poly(lactic-co-glycolic acid) microsphere. Biomaterials. 30 (25), 4227-4232 (2009).
- Fan, D., et al. Mesoporous silicon-PLGA composite microspheres for the double controlled release of biomolecules for orthopedic tissue Engineering. Advanced Functional Materials. 22 (2), 282-293 (2012).
- Xu, Y., et al. Metabolism balance regulation via antagonist-functionalized injectable microsphere for nucleus pulposus regeneration. Advanced Functional Materials. 30 (52), 2006333 (2020).
- Yao, R., Zhang, R., Lin, F., Luan, J. Injectable cell/hydrogel microspheres induce the formation of fat lobule-like microtissues and vascularized adipose tissue regeneration. Biofabrication. 4 (4), 045003 (2012).
- Sikavitsas, V. I., Bancroft, G. N., Mikos, A. G. Formation of three-dimensional cell/polymer constructs for bone tissue engineering in a spinner flask and a rotating wall vessel bioreactor. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (1), 136-148 (2002).
- Kim, T. K., Yoon, J. J., Lee, D. S., Park, T. G. Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres. Biomaterials. 27 (2), 152-159 (2006).
- Wang, C. Y., Liao, H. F., Sheu, D. C. Enhancement of recombinant human macrophage colony-stimulating factor production using culture systems with porous polymeric microspheres. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 41 (2), 203-208 (2010).
- Amoyav, B., Benny, O. Microfluidic based fabrication and characterization of highly porous polymeric microspheres. Polymers. 11 (3), 419 (2019).
- Zhang, H., et al. Microfluidic fabrication of inhalable large porous microspheres loaded with H2S-releasing aspirin derivative for pulmonary arterial hypertension therapy. Journal of Controlled Release. 329, 286-298 (2021).
- Qu, M., et al. Injectable open-porous PLGA microspheres as cell carriers for cartilage regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 109 (11), 2091-2100 (2021).
- Zheng, Y., et al. Microfluidic droplet-based functional materials for cell manipulation. Lab on a Chip. 21 (22), 4311-4329 (2021).
- Kawakatsu, T., Kikuchi, Y., Nakajima, M. Regular-sized cell creation in microchannel emulsification by visual microprocessing method. Journal of the American Oil Chemists’ Society. 74 (3), 317-321 (1997).
- Yu, Y., Shang, L., Guo, J., Wang, J., Zhao, Y. Design of capillary microfluidics for spinning cell-laden microfibers. Nature Protocols. 13 (11), 2557-2579 (2018).
- Ye, B., et al. Photonic crystal microcapsules for label-free multiplex detection. Advanced Materials. 26 (20), 3270-3274 (2014).
- Zhong, Z., et al. Zn/Sr dual ions-collagen co-assembly hydroxyapatite enhances bone regeneration through procedural osteo-immunomodulation and osteogenesis. Bioactive Materials. 10, 195-206 (2022).
- Poole, C. A., Brookes, N. H., Clover, G. M. Keratocyte networks visualized in the living cornea using vital dyes. Journal of Cell Science. 106 (2), 685-692 (1993).
- Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An overview of poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 3640-3659 (2014).
- Lanao, R. P. F., et al. Physicochemical properties and applications of Poly(lactic-co-glycolic acid) for use in bone regeneration. Tissue Engineering Part B-Reviews. 19 (4), 380-390 (2013).
