O presente protocolo descreve a fabricação de microesferas porosas altamente abertas (HOPMs) à base de poli(ácido lático-co-glicólico) através da tecnologia microfluídica fácil baseada em formulação de emulsão única. Essas microesferas têm aplicações potenciais em engenharia de tecidos e triagem de medicamentos.
Em comparação com andaimes a granel e injeção direta de células sozinhas, as unidades modulares injetáveis atraíram enorme interesse em reparar tecidos com defeito devido à conveniência na embalagem das células, melhor retenção de células e invasividade mínima. Além disso, a conformação porosa desses portadores de microescala poderia aumentar a troca de meios e melhorar o nível de nutrientes e suprimentos de oxigênio. O presente estudo ilustra a fabricação conveniente de microesferas porosas altamente abertas à base de poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA-HOPMs) pela tecnologia microfluídica fácil para aplicações de entrega celular. Os PLGA-HOPMs monodispersos resultantes possuíam tamanhos de partículas de ~400 μm e poros abertos de ~50 μm com janelas interligadas. Resumidamente, as gotículas de óleo emulsionadas (solução PLGA em diclorometano, DCM), envoltas com a fase aquosa gelatinosa a 7,5% (p/v), foram introduzidas na solução aquosa de poli(álcool vinílico) (PVA) de fluxo contínuo a 1% (p/v) através do bocal coaxial na configuração microfluídica personalizada. Posteriormente, as microesferas foram submetidas a procedimentos de extração e liofilização com solvente, resultando na produção de HOPMs. Notavelmente, várias formulações (concentrações de PLGA e porogênio) e parâmetros de processamento (potência emulsificante, medidor de agulha e taxa de fluxo de fase dispersa) desempenham papéis cruciais nas qualidades e características dos HOPMs PLGA resultantes. Além disso, essas arquiteturas podem potencialmente encapsular várias outras pistas bioquímicas, como fatores de crescimento, para a descoberta prolongada de medicamentos e aplicações de regeneração de tecidos.
Microesferas carregadas de células oferecem vantagens favoráveis, como maior capacidade de retenção celular in situ, entrega eficiente de células e subsequente capacidade de proliferação celular in vivo1. Até o momento, inúmeras investigações foram apresentadas para o desenvolvimento de uma estrutura de andaimes bem-sucedida para suportar um ambiente propício para células para regeneração tecidual ou aplicações de triagem de drogas2. No entanto, o ambiente de hipóxia é muitas vezes inevitável no interior devido ao fornecimento insuficiente de nutrientes/oxigênio e acúmulo de resíduos metabólicos3. Para superar esses problemas, microesferas (MPs) altamente porosas têm sido desenvolvidas utilizando diversos biomateriais 4,5,6. Além disso, em cultura dinâmica, os andaimes sofrem de tensão de cisalhamento excessiva7, e o estado instável do meio de cultura pode quebrar a fidelidade dos PMs. Alternativamente, o poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) poderia ser usado para processar PMs com boa resistência mecânica para cultura dinâmica1. Por exemplo, demonstramos a co-injeção de microbastonetes ocos de poli(etilenoglicol) carregados de PLGA carregados de mioblastos (C2C12) de camundongos e microbastonetes ocos de poli(etilenoglicol) carregados de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) para curar a perda muscular volumétrica, alcançando notável melhora da regeneração muscular esquelética in situ 8.
Notavelmente, os PMs são caracterizados por grandes áreas superficiais e altas porosidades, o que é de interesse específico para a adesão e crescimento celular para a entrega celular minimamente invasiva9. Diante desses aspectos, diversos materiais biocompatíveis têm sido empregados para a fabricação dos MPs10,11. Esses PMs projetáveis cocultivados com células oferecem excelente aderência, considerável resistência mecânica e janelas altamente interconectadas, o que poderia melhorar a proliferação celular para reparar tecidos danificados12. Nesse sentido, diversas tecnologias também têm sido desenvolvidas para fabricar esferas porosas13,14. Por um lado, os PMs foram produzidos por meio de agentes formadores de gás, como o NH4HCO3, que foram contidos devido à insuficiente interconectividade15,16,17. Por outro lado, os PMs foram tosquiados diretamente após a emulsificação, o que levou a PMs polidispersos18. No final, a tecnologia microfluídica de gotículas baseada na abordagem de modelagem de emulsão talvez seja um método eficiente para a construção de PMs, pois muitas vezes resulta em partículas de tamanho uniforme19. Notavelmente, os atributos morfológicos das microesferas muitas vezes dependem da qualidade das gotículas de emulsão geradas (ou seja, água em óleo, W/O ou óleo em água, O/W), o que pode afetar significativamente os atributos dos biomateriais20. Vale a pena notar que a plataforma microfluídica pré-projetada pode ser aplicada para gerar as microfibras ou microesferas. Em um exemplo, Yu et al. demonstraram a produção de estruturas microfibrosas carregadas de células baseadas em plataformas microfluídicas baseadas em capilares, que poderiam ser usadas para montar redes celulares para imitar tecidos naturais21. Em outro caso, Ye et al. fabricaram microcápsulas de cristal fotônico pela replicação de molde de esferas de cristal coloidal de sílica por meio de tecnologias microfluídicas, o que poderia superar muitas limitações das técnicas atuais que requerem rotulagem complexa e aparelhos específicos22.
De fato, a lógica por trás da utilização dessa técnica se deve a várias vantagens, como ser fácil por natureza, não exigir equipamentos sofisticados e sua conveniência na síntese de PMs de tamanho uniforme para entrega celular e aplicações de medicina regenerativa. Neste contexto, com componentes pré-projetados de emulsão-modelagem, PMs com altas porosidades e interconectividade podem ser convenientemente obtidos a partir de um dispositivo microfluídico montado a partir de tubos de poli(cloreto de vinila) (PVC), um capilar de vidro e uma agulha. Uma emulsão-precursora de W/O é preparada homogeneizando uma solução aquosa de gelatina e uma solução orgânica de PLGA. Ao injetar seletivamente a porção aplicável da emulsão na plataforma microfluídica, os PMs com tamanhos de partículas uniformes e poros interconectados em toda a superfície para o interior são fabricados. O presente protocolo tem como objetivo fabricar os PLGA-HOPMs por emulsão-modelagem na plataforma microfluídica. Acredita-se que este protocolo permite a produção reprodutível de PLGA-HOPMs e será potencialmente aplicável em seus campos relacionados de engenharia de tecidos e triagem de medicamentos.
Este artigo descreve uma estratégia eficiente para fabricar arquiteturas baseadas em PLGA, ou seja, os PLGA-HOPMs. Deve-se notar que várias etapas críticas devem ser tomadas com cuidado, incluindo evitar a volatilização do solvente do PLGA e o ajuste suave da potência ultra-sônica para a posição alvo durante a preparação da emulsão. Além disso, a saída líquida da seringa de 20 mL pode ser ajustada até certo ponto para resolver a separação de fases de precursores emulsionados. No entanto, uma limitação…
The authors have nothing to disclose.
SCL, YW, RKK e AZC reconhecem o apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC, 32071323, 81971734 e U1605225) e do Programa para a Equipe de Pesquisa Inovadora em Ciência e Tecnologia na Universidade da Província de Fujian. A YSZ não foi apoiada por nenhum desses programas nem recebeu pagamento de qualquer tipo; em vez disso, o apoio do Brigham Research Institute é reconhecido.
Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |