ייצור מיקרוספרות נקבוביות פתוחות במיוחד (HOPMs) באמצעות טכנולוגיה מיקרופלואידית
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר ייצור של מיקרוספרות נקבוביות פתוחות מאוד (HOPMs) המבוססות על פולי(חומצה לקטית-קו-גליקולית) באמצעות טכנולוגיית מיקרופלואידית מבוססת תחליב יחיד. למיקרוספרות אלה יש יישומים פוטנציאליים בהנדסת רקמות ובבדיקת תרופות.
Abstract
בהשוואה לפיגומים בתפזורת והזרקה ישירה של תאים בלבד, היחידות המודולריות הניתנות להזרקה זכו לעניין עצום בתיקון רקמות לא תקינות בשל הנוחות באריזות התאים, שימור תאים משופר ופולשניות מינימלית. יתר על כן, הקונפורמציה הנקבובית של נשאים זעירים אלה יכולה לשפר את חילופי הבינוניים ולשפר את רמת חומרי המזון ואספקת החמצן. המחקר הנוכחי ממחיש את הייצור הנוח של מיקרוספרות נקבוביות פתוחות מאוד (PLGA-HOPMs) המבוססות על פולי(חומצה לקטית-קו-גליקולית) על ידי הטכנולוגיה המיקרופלואידית של facile עבור יישומי העברת תאים. ה- PLGA-HOPMs החד-ממדיים שהתקבלו היו בעלי גודל חלקיקים של ~ 400 מיקרומטר ונקבוביות פתוחות של ~ 50 מיקרומטר עם חלונות מחוברים. בקצרה, טיפות השמן המתחלבות (תמיסת PLGA בדיכלורומתאן, DCM), עטופות בפאזה המימית של ג’לטין 7.5% (w/v), הוכנסו לתמיסה המימית של 1% (w/v) פולי(ויניל אלכוהול) (PVA) הזורם באופן רציף דרך הזרבובית הקואקסיאלית במערך המיקרופלואידי המותאם אישית. לאחר מכן, המיקרוספרות היו נתונות להליכי מיצוי ממסים וליופיליזציה, וכתוצאה מכך לייצור HOPMs. יש לציין כי פורמולציות שונות (ריכוזים של PLGA ופורוגן) ופרמטרים לעיבוד (כוח תחליב, מד מחט וקצב זרימה של פאזה מפוזרת) ממלאים תפקידים מכריעים באיכויות ובמאפיינים של ה- PLGA HOPMs המתקבלים. יתר על כן, ארכיטקטורות אלה עשויות לתמצת רמזים ביוכימיים שונים אחרים, כגון גורמי גדילה, לגילוי תרופות מורחב וליישומים של התחדשות רקמות.
Introduction
מיקרוספרות עמוסות תאים מציעות יתרונות חיוביים, כגון יכולת שימור תאים משופרת באתרה, אספקה יעילה של תאים, ויכולת נוספת של התפשטות תאים in vivo1. עד כה, נערכו מחקרים רבים לפיתוח מבנה פיגומים מוצלח לתמיכה בסביבה תורמת לתאים להתחדשות רקמות או ליישומי סינון תרופות2. עם זאת, סביבת היפוקסיה היא לעתים קרובות בלתי נמנעת בפנים עקב אספקה מספקת של חומרים מזינים / חמצן והצטברות פסולת מטבולית3. כדי להתגבר על בעיות אלה, מיקרוספרות נקבוביות מאוד (PMs) פותחו באמצעות ביו-חומריםשונים 4,5,6. בנוסף, בתרבות דינמית, הפיגומים סובלים מלחץ גזירה מוגזם7, והמצב הלא יציב של מדיום התרבית עלול לשבור את הנאמנות של PMs. לחלופין, ניתן להשתמש בפולי (חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) לעיבוד PMs עם חוזק מכני טוב לתרבית דינמית1. לדוגמה, הדגמנו הזרקה משותפת של מיובלסט עכבר (C2C12) עמוס PLGA פתוח מאוד PMs (HOPMs) ותאי אנדותל של ורידים אנושיים (HUVEC) עמוסי פולי(אתילן גליקול) מיקרורודים חלולים כדי לרפא אובדן שריר נפחי, ולהשיג שיפור מדהים של התחדשות שרירי השלד באתרו 8.
יש לציין כי PMs מאופיינים בשטחי פנים גדולים ונקבוביות גבוהות, וזה עניין ספציפי להידבקות תאים וצמיחה לקראת אספקת תאים זעיר פולשנית9. לאור היבטים אלה, נעשה שימוש בחומרים שונים בעלי תאימות ביולוגית כדי לייצר אתה-PMs 10,11. ה-PMs הניתנים לתכנון יחד עם תאים מציעים הידבקות מצוינת, חוזק מכני ניכר וחלונות מחוברים מאוד, שיכולים לשפר את התפשטות התאים לתיקון רקמות פגומות12. בהקשר זה, טכנולוגיות שונות פותחו גם כדי לייצר כדורים נקבוביים13,14. מצד אחד, PMs הופקו באמצעות חומרים יוצרי גז, כגון NH4HCO3, אשר רוסנו עקב קישוריותמספקת 15,16,17. מאידך גיסא, PMs נגזו ישירות לאחר אמולסיפיקציה, מה שהוביל לפולידיספרס PMs18. בסופו של דבר, הטכנולוגיה המיקרופלואידית של הטיפות המבוססת על גישת האמולסיה-טמפלציה היא אולי שיטה יעילה לבניית PMs, מכיוון שלעתים קרובות היא גורמת לחלקיקים בגודל אחיד19. יש לציין כי התכונות המורפולוגיות של המיקרוספרות תלויות לעתים קרובות באיכות טיפות האמולסיה הנוצרות (כלומר, מים בשמן, W/O, או שמן במים, O/W), אשר עשויות להשפיע באופן משמעותי על תכונות הביו-חומרים20. ראוי לציין כי ניתן ליישם את הפלטפורמה המיקרופלואידית שתוכננה מראש כדי ליצור את המיקרופייברים או המיקרוספרות. לדוגמה, Yu et al. הדגימו ייצור של מבנים מיקרו-פיסיביים עמוסי תאים המבוססים על פלטפורמות מיקרופלואידיות מבוססות נימים, אשר יכולות לשמש להרכבת רשתות תאיות לחיקוי רקמות טבעיות21. במקרה אחר, Ye et al. ייצרו מיקרו-קפסולות גבישים פוטוניים על ידי שכפול תבנית של חרוזי גביש קולואידיים סיליקה באמצעות טכנולוגיות מיקרופלואידיות, שיכלו להתגבר על מגבלות רבות של טכניקות עכשוויות הדורשות תיוג מורכב ומנגנון ספציפי22.
ואכן, הרציונל מאחורי השימוש בטכניקה זו נובע מיתרונות שונים, כגון היותה נוחה באופיה, שאינה דורשת ציוד מתוחכם, והנוחות שלה בסינתזה של PMs בגודל אחיד ליישומי אספקת תאים ורפואה רגנרטיבית. בהקשר זה, עם רכיבים שתוכננו מראש של תחליב-טמפלאט, ניתן לקבל בנוחות PMs עם נקבוביות גבוהות וקישוריות מהתקן מיקרופלואידי המורכב מצינורות פולי(ויניל כלוריד) (PVC), נימי זכוכית ומחט. תחליב-מבשר W/O מוכן על ידי הומוגניזציה של תמיסה מימית של ג’לטין ותמיסה אורגנית של PLGA. על ידי הזרקה סלקטיבית של החלק הישים של האמולסיה לתוך הפלטפורמה המיקרופלואידית, ה- PMs עם גדלי חלקיקים אחידים ונקבוביות מחוברות זו לזו לאורך פני השטח לפנים מפוברקים. הפרוטוקול הנוכחי נועד לייצר את ה-PLGA-HOPMs על ידי תחליב-טמפלינג בפלטפורמה המיקרופלואידית. ההערכה היא כי פרוטוקול זה מאפשר ייצור ניתן לשחזור של PLGA-HOPMs ועשוי להיות ישים בתחומים הקשורים שלהם של הנדסת רקמות ובדיקת תרופות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר אסטרטגיה יעילה לייצור ארכיטקטורות מבוססות PLGA, כלומר PLGA-HOPMs. יש לציין כי יש לנקוט בזהירות במספר צעדים קריטיים, כולל הימנעות מהתנשאות ממס של PLGA והתאמה עדינה של הכוח הקולי למצב המטרה במהלך הכנת התחליב. בנוסף, מוצא נוזלי של מזרק 20 מ”ל יכול להיות מותאם במידה מסוימת כדי לפתור את הפרדת …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SCL, YW, RKK ו- AZC מכירים בתמיכה כספית מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC, 32071323, 81971734 ו- U1605225) ותוכנית לצוות מחקר חדשני במדע וטכנולוגיה באוניברסיטת מחוז פוג’יאן. YSZ לא נתמך על ידי אף אחת מתוכניות אלה ולא קיבל תשלום מכל סוג שהוא; במקום זאת, תמיכה ממכון המחקר בריגהם זוכה להכרה.
Materials
| Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
| Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
| Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
| DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
| Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
| Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
| Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
| Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
| Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
| Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
| Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
| Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
| PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
| Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
| Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
| Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
| Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
| Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
| Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
| UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |
References
- Kankala, R. K., et al. Highly porous microcarriers for minimally invasive in situ skeletal muscle cell delivery. Small. 15 (25), 1901397 (2019).
- Wang, Y., et al. Modeling endothelialized hepatic tumor microtissues for drug screening. Advanced Science. 7 (21), 2002002 (2020).
- Li, Q., et al. Tripeptide-based macroporous hydrogel improves the osteogenic microenvironment of stem cells. Journal of Materials Chemistry B. 9 (30), 6056-6067 (2021).
- Liu, Y., et al. PLGA hybrid porous microspheres as human periodontal ligament stem cell delivery carriers for periodontal regeneration. Chemical Engineering Journal. 420, 129703 (2021).
- Wei, P., Xu, Y., Zhang, H., Wang, L. Continued sustained insulin-releasing PLGA nanoparticles modified 3D-printed PCL composite scaffolds for osteochondral repair. Chemical Engineering Journal. 422, 130051 (2021).
- Sang, S., et al. Biocompatible chitosan/polyethylene glycol/multi-walled carbon nanotube composite scaffolds for neural tissue engineering. Journal of Zhejiang University-Science B. 23 (1), 58-73 (2022).
- Ghasemian, M., et al. Hydrodynamic characterization within a spinner flask and a rotary wall vessel for stem cell culture. Biochemical Engineering Journal. 157, 107533 (2020).
- Wang, Y., et al. Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration. Biomaterials. 277, 121072 (2021).
- Kang, S. W., Bae, Y. H. Cryopreservable and tumorigenic three-dimensional tumor culture in porous poly(lactic-co-glycolic acid) microsphere. Biomaterials. 30 (25), 4227-4232 (2009).
- Fan, D., et al. Mesoporous silicon-PLGA composite microspheres for the double controlled release of biomolecules for orthopedic tissue Engineering. Advanced Functional Materials. 22 (2), 282-293 (2012).
- Xu, Y., et al. Metabolism balance regulation via antagonist-functionalized injectable microsphere for nucleus pulposus regeneration. Advanced Functional Materials. 30 (52), 2006333 (2020).
- Yao, R., Zhang, R., Lin, F., Luan, J. Injectable cell/hydrogel microspheres induce the formation of fat lobule-like microtissues and vascularized adipose tissue regeneration. Biofabrication. 4 (4), 045003 (2012).
- Sikavitsas, V. I., Bancroft, G. N., Mikos, A. G. Formation of three-dimensional cell/polymer constructs for bone tissue engineering in a spinner flask and a rotating wall vessel bioreactor. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (1), 136-148 (2002).
- Kim, T. K., Yoon, J. J., Lee, D. S., Park, T. G. Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres. Biomaterials. 27 (2), 152-159 (2006).
- Wang, C. Y., Liao, H. F., Sheu, D. C. Enhancement of recombinant human macrophage colony-stimulating factor production using culture systems with porous polymeric microspheres. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 41 (2), 203-208 (2010).
- Amoyav, B., Benny, O. Microfluidic based fabrication and characterization of highly porous polymeric microspheres. Polymers. 11 (3), 419 (2019).
- Zhang, H., et al. Microfluidic fabrication of inhalable large porous microspheres loaded with H2S-releasing aspirin derivative for pulmonary arterial hypertension therapy. Journal of Controlled Release. 329, 286-298 (2021).
- Qu, M., et al. Injectable open-porous PLGA microspheres as cell carriers for cartilage regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 109 (11), 2091-2100 (2021).
- Zheng, Y., et al. Microfluidic droplet-based functional materials for cell manipulation. Lab on a Chip. 21 (22), 4311-4329 (2021).
- Kawakatsu, T., Kikuchi, Y., Nakajima, M. Regular-sized cell creation in microchannel emulsification by visual microprocessing method. Journal of the American Oil Chemists’ Society. 74 (3), 317-321 (1997).
- Yu, Y., Shang, L., Guo, J., Wang, J., Zhao, Y. Design of capillary microfluidics for spinning cell-laden microfibers. Nature Protocols. 13 (11), 2557-2579 (2018).
- Ye, B., et al. Photonic crystal microcapsules for label-free multiplex detection. Advanced Materials. 26 (20), 3270-3274 (2014).
- Zhong, Z., et al. Zn/Sr dual ions-collagen co-assembly hydroxyapatite enhances bone regeneration through procedural osteo-immunomodulation and osteogenesis. Bioactive Materials. 10, 195-206 (2022).
- Poole, C. A., Brookes, N. H., Clover, G. M. Keratocyte networks visualized in the living cornea using vital dyes. Journal of Cell Science. 106 (2), 685-692 (1993).
- Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An overview of poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 3640-3659 (2014).
- Lanao, R. P. F., et al. Physicochemical properties and applications of Poly(lactic-co-glycolic acid) for use in bone regeneration. Tissue Engineering Part B-Reviews. 19 (4), 380-390 (2013).
