マイクロ流体技術 による 高開放多孔質ミクロスフェア(HOTM)の作製
Summary
本プロトコルは、単一エマルジョン製剤ベースの簡単なマイクロ流体技術を介したポリ(乳酸-co-グリコール酸)ベースの高開口多孔質ミクロスフェア(HOPM)の製造について説明しています。これらのミクロスフェアは、組織工学や薬物スクリーニングに応用できる可能性があります。
Abstract
バルク足場や細胞のみの直接注入と比較して、注射可能なモジュラーユニットは、細胞のパッケージングの利便性、細胞保持の改善、および侵襲性の最小化により、機能不全の組織の修復に大きな関心を集めています。さらに、これらのマイクロスケール担体の多孔質コンフォメーションは、培地交換を強化し、栄養素と酸素供給のレベルを改善する可能性があります。本研究は、細胞送達アプリケーションのための簡単なマイクロ流体技術によるポリ(乳酸-co-グリコール酸)ベースの高開放多孔質ミクロスフェア(PLGA-HOPM)の簡便な製造を示しています。得られた単分散PLGA-HOPMは、~400 μmの粒径と~50 μmの開孔を有し、相互接続窓を有していた。簡単に説明すると、7.5%(w / v)ゼラチン水相で包まれた乳化油滴(ジクロロメタン中のPLGA溶液、DCM)を、カスタマイズされたマイクロ流体セットアップの同軸ノズルを介して1%(w / v)連続的に流れるポリ(ビニルアルコール)(PVA)水溶液に導入しました。続いて、ミクロスフェアを溶媒抽出および凍結乾燥手順にかけ、その結果、HOPMが製造されました。特に、さまざまな配合(PLGAとポロジェンの濃度)と処理パラメータ(乳化力、ニードルゲージ、分散相の流量)は、得られるPLGA HOPMの品質と特性に重要な役割を果たします。さらに、これらのアーキテクチャは、拡張された創薬および組織再生アプリケーションのために、成長因子などの他のさまざまな生化学的手がかりをカプセル化する可能性があります。
Introduction
細胞を含んだミクロスフェアは、in situでの細胞保持能力の向上、細胞の効率的な送達、およびその後のin vivoでの細胞増殖能力などの好ましい利点を提供します1。現在までに、組織再生または薬物スクリーニングアプリケーションのための細胞の助長環境をサポートするための成功した足場構造を開発するために、多くの研究が提唱されてきました2。しかし、低酸素環境は、栄養素/酸素の供給不足と代謝廃棄物の蓄積のために、内部で避けられないことがよくあります3。これらの問題を克服するために、様々な生体材料を用いて高多孔性ミクロスフェア(PM)が開発されてきた4,5,6。さらに、動的培養では、足場は過度のせん断応力7に悩まされ、培地の不安定な状態はPMの忠実度を損なう可能性があります。 あるいは、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)を使用して、動的培養用の機械的強度に優れたPMを処理することもできます1。例えば、マウス筋芽細胞(C2C12)を配合したPLGA高開放型PM(HOPM)とヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を配合したポリ(エチレングリコール)中空マイクロロッドを同時注射し、体積筋の喪失を治癒させることで実証し、in situ骨格筋再生の著しい改善を達成しました8。
特に、PMは大きな表面積と高い多孔性を特徴とし、これは細胞接着と低侵襲細胞送達に向けた成長に特に関心があります9。これらの態様を考慮して、PM10、11を製造するために様々な生体適合性材料が採用されてきた。細胞と共培養されたこれらの設計可能なPMは、優れた接着性、かなりの機械的強度、および高度に相互接続された窓を提供し、損傷した組織を修復するための細胞増殖を改善する可能性があります12。これに関して、多孔質球体13、14を作製するための様々な技術も開発されている。一方では、PMはNH4HCO3などのガス形成剤を使用して製造され、相互接続性が不十分なために抑制されました15,16,17。一方、PMは乳化後に直接せん断され、多分散PM18につながった。結局、エマルジョンテンプレートアプローチに基づく液滴マイクロ流体技術は、均一なサイズの粒子をもたらすことが多いため、PMを構築するための効率的な方法である可能性があります19。特に、ミクロスフェアの形態学的属性は、生成されたエマルジョン液滴の品質(すなわち、油中水型W/O、または水中油型O/W)に依存することが多く、これは生体材料の属性に大きく影響し得る20。事前に設計されたマイクロ流体プラットフォームを適用して、マイクロファイバーまたはマイクロスフェアを生成できることは注目に値します。ある例では、Yuらは、毛細管ベースのマイクロ流体プラットフォームに基づく細胞を含んだ微小繊維構造体の生成を実証し、これは天然組織を模倣するための細胞ネットワークを組み立てるために使用できる21。別の例では、Yeらは、マイクロ流体技術を通じてシリカコロイド結晶ビーズのテンプレート複製によってフォトニック結晶マイクロカプセルを作製し、これは複雑な標識および特定の装置を必要とする現在の技術の多くの制限を克服することができた22。
実際、この技術を利用する理由は、性質が簡単であること、高度な機器を必要としないこと、細胞送達や再生医療用途で均一なサイズのPMを合成する際の利便性など、さまざまな利点によるものです。これに関連して、エマルジョンテンプレートの事前に設計されたコンポーネントを使用すると、ポリ(塩化ビニル)(PVC)チューブ、ガラスキャピラリー、および針から組み立てられたマイクロ流体デバイスから、高い気孔率と相互接続性を備えたPMを便利に得ることができます。W/Oエマルション前駆体は、ゼラチン水溶液とPLGAの有機溶液を均質化することによって調製されます。エマルジョンの適用部分を選択的にマイクロ流体プラットフォームに注入することにより、均一な粒子サイズと表面全体から内部までの相互接続された細孔を有するPMが製造される。本プロトコルは、マイクロ流体プラットフォームでのエマルジョンテンプレート化によってPLGA-HOPMを作製することを目的としています。このプロトコルは、PLGA-HOPMの再現性のある生産を可能にし、組織工学および薬物スクリーニングの関連分野に適用できる可能性があると考えられています。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、PLGAベースのアーキテクチャ、つまりPLGA-HOPMを製造するための効率的な戦略について説明します。PLGAの溶媒揮発の回避およびエマルジョンの調製中の標的位置への超音波パワーの穏やかな調整を含む、いくつかの重要なステップを慎重に行わなければならないことに留意されたい。さらに、20mLシリンジの液体出口は、乳化前駆体の相分離を解決するためにある程度調整するこ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SCL、YW、RKK、AZCは、中国国家自然科学財団(NSFC、32071323、81971734、およびU1605225)および福建省大学の科学技術革新研究チームプログラムからの財政的支援を認めています。YSZはこれらのプログラムのいずれによってもサポートされておらず、いかなる種類の支払いも受け取っていませんでした。代わりに,ブリガム・リサーチ・インスティテュートからの支援が認められています。
Materials
| Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
| Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
| Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
| DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
| Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
| Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
| Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
| Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
| Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
| Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
| Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
| Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
| PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
| Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
| Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
| Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
| Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
| Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
| Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
| UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |
References
- Kankala, R. K., et al. Highly porous microcarriers for minimally invasive in situ skeletal muscle cell delivery. Small. 15 (25), 1901397 (2019).
- Wang, Y., et al. Modeling endothelialized hepatic tumor microtissues for drug screening. Advanced Science. 7 (21), 2002002 (2020).
- Li, Q., et al. Tripeptide-based macroporous hydrogel improves the osteogenic microenvironment of stem cells. Journal of Materials Chemistry B. 9 (30), 6056-6067 (2021).
- Liu, Y., et al. PLGA hybrid porous microspheres as human periodontal ligament stem cell delivery carriers for periodontal regeneration. Chemical Engineering Journal. 420, 129703 (2021).
- Wei, P., Xu, Y., Zhang, H., Wang, L. Continued sustained insulin-releasing PLGA nanoparticles modified 3D-printed PCL composite scaffolds for osteochondral repair. Chemical Engineering Journal. 422, 130051 (2021).
- Sang, S., et al. Biocompatible chitosan/polyethylene glycol/multi-walled carbon nanotube composite scaffolds for neural tissue engineering. Journal of Zhejiang University-Science B. 23 (1), 58-73 (2022).
- Ghasemian, M., et al. Hydrodynamic characterization within a spinner flask and a rotary wall vessel for stem cell culture. Biochemical Engineering Journal. 157, 107533 (2020).
- Wang, Y., et al. Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration. Biomaterials. 277, 121072 (2021).
- Kang, S. W., Bae, Y. H. Cryopreservable and tumorigenic three-dimensional tumor culture in porous poly(lactic-co-glycolic acid) microsphere. Biomaterials. 30 (25), 4227-4232 (2009).
- Fan, D., et al. Mesoporous silicon-PLGA composite microspheres for the double controlled release of biomolecules for orthopedic tissue Engineering. Advanced Functional Materials. 22 (2), 282-293 (2012).
- Xu, Y., et al. Metabolism balance regulation via antagonist-functionalized injectable microsphere for nucleus pulposus regeneration. Advanced Functional Materials. 30 (52), 2006333 (2020).
- Yao, R., Zhang, R., Lin, F., Luan, J. Injectable cell/hydrogel microspheres induce the formation of fat lobule-like microtissues and vascularized adipose tissue regeneration. Biofabrication. 4 (4), 045003 (2012).
- Sikavitsas, V. I., Bancroft, G. N., Mikos, A. G. Formation of three-dimensional cell/polymer constructs for bone tissue engineering in a spinner flask and a rotating wall vessel bioreactor. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (1), 136-148 (2002).
- Kim, T. K., Yoon, J. J., Lee, D. S., Park, T. G. Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres. Biomaterials. 27 (2), 152-159 (2006).
- Wang, C. Y., Liao, H. F., Sheu, D. C. Enhancement of recombinant human macrophage colony-stimulating factor production using culture systems with porous polymeric microspheres. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 41 (2), 203-208 (2010).
- Amoyav, B., Benny, O. Microfluidic based fabrication and characterization of highly porous polymeric microspheres. Polymers. 11 (3), 419 (2019).
- Zhang, H., et al. Microfluidic fabrication of inhalable large porous microspheres loaded with H2S-releasing aspirin derivative for pulmonary arterial hypertension therapy. Journal of Controlled Release. 329, 286-298 (2021).
- Qu, M., et al. Injectable open-porous PLGA microspheres as cell carriers for cartilage regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 109 (11), 2091-2100 (2021).
- Zheng, Y., et al. Microfluidic droplet-based functional materials for cell manipulation. Lab on a Chip. 21 (22), 4311-4329 (2021).
- Kawakatsu, T., Kikuchi, Y., Nakajima, M. Regular-sized cell creation in microchannel emulsification by visual microprocessing method. Journal of the American Oil Chemists’ Society. 74 (3), 317-321 (1997).
- Yu, Y., Shang, L., Guo, J., Wang, J., Zhao, Y. Design of capillary microfluidics for spinning cell-laden microfibers. Nature Protocols. 13 (11), 2557-2579 (2018).
- Ye, B., et al. Photonic crystal microcapsules for label-free multiplex detection. Advanced Materials. 26 (20), 3270-3274 (2014).
- Zhong, Z., et al. Zn/Sr dual ions-collagen co-assembly hydroxyapatite enhances bone regeneration through procedural osteo-immunomodulation and osteogenesis. Bioactive Materials. 10, 195-206 (2022).
- Poole, C. A., Brookes, N. H., Clover, G. M. Keratocyte networks visualized in the living cornea using vital dyes. Journal of Cell Science. 106 (2), 685-692 (1993).
- Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An overview of poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 3640-3659 (2014).
- Lanao, R. P. F., et al. Physicochemical properties and applications of Poly(lactic-co-glycolic acid) for use in bone regeneration. Tissue Engineering Part B-Reviews. 19 (4), 380-390 (2013).
