미세유체 기술을 통한 고도로 개방된 다공성 마이크로스피어(HOPM) 제작
Summary
본 프로토콜은 단일 에멀젼 제형 기반 facile 미세 유체 기술을 통해 폴리 (락틱-코-글리콜 산) 기반 고도로 개방 된 다공성 미세 구체 (HOPM)의 제조를 설명합니다. 이 마이크로스피어는 조직 공학 및 약물 스크리닝에 잠재적으로 응용될 수 있습니다.
Abstract
벌크 스캐폴드 및 세포 단독 직접 주입과 비교할 때, 주사 가능한 모듈식 장치는 세포 포장의 편의성, 향상된 세포 보유 및 최소 침습성으로 인해 오작동하는 조직을 복구하는 데 엄청난 관심을 받았습니다. 또한, 이러한 마이크로 스케일 캐리어의 다공성 형태는 매체 교환을 향상시키고 영양소 및 산소 공급 수준을 향상시킬 수 있습니다. 본 연구는 세포 전달 응용 분야를 위한 손쉬운 미세유체 기술에 의한 폴리(락틱-코-글리콜산) 기반 고도로 개방된 다공성 미세구(PLGA-HOPM)의 편리한 제조를 보여줍니다. 그 결과 단분산 PLGA-HOPM은 ~400μm의 입자 크기와 상호 연결 창이 있는 ~50μm의 열린 기공을 가졌습니다. 간단히 말해서, 7.5%(w/v) 젤라틴 수용액으로 싸인 유화 오일 방울(디클로로메탄 중 PLGA 용액, DCM)을 맞춤형 미세 유체 설정에서 동축 노즐을 통해 1%(w/v) 연속 흐르는 폴리(비닐 알코올)(PVA) 수용액에 도입했습니다. 그 후, 마이크로스피어는 용매 추출 및 동결건조 절차를 거쳐 HOPM을 생성했습니다. 특히, 다양한 제형(PLGA 및 포로겐의 농도) 및 처리 매개변수(유화력, 바늘 게이지 및 분산상의 유속)는 결과 PLGA HOPM의 품질과 특성에 중요한 역할을 합니다. 또한, 이러한 아키텍처는 확장 된 약물 발견 및 조직 재생 응용 분야를 위해 성장 인자와 같은 다양한 다른 생화학 적 단서를 잠재적으로 캡슐화 할 수 있습니다.
Introduction
세포-함유 마이크로스피어는 향상된 제자리 세포 보유 능력, 세포의 효율적인 전달 및 생체내1에서의 세포 증식의 후속 능력과 같은 유리한 이점을 제공한다. 현재까지 조직 재생 또는 약물 스크리닝 응용 프로그램을 위한 세포에 도움이 되는 환경을 지원하기 위해 성공적인 스캐폴딩 구조를 개발하기 위한 수많은 연구가 진행되었습니다2. 그러나 저산소증 환경은 영양소/산소 공급 부족 및 대사성 폐기물 축적으로 인해 내부에서 불가피한 경우가많습니다3. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 다양한 생체재료(4,5,6)를 이용하여 고다공성 마이크로스피어(PM)가 개발되었다. 추가적으로, 동적 배양에서, 스캐폴드는 과도한 전단 응력7을 겪고, 배양 배지의 불안정한 상태는 PM의 충실도를 깨뜨릴 수 있다. 대안적으로, 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA)는 동적 배양1을 위해 우수한 기계적 강도를 갖는 PM을 처리하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 우리는 체적 근육 손실을 치유하기 위해 마우스 근원 세포 (C2C12)가 함유 된 PLGA 고도로 개방 PM (HOPM)과 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)가 함유 된 폴리 (에틸렌 글리콜) 중공 마이크로 로드의 동시 주입을 입증하여 현장 골격근 재생의 현저한 개선을 달성했습니다8.
특히, PM은 넓은 표면적 및 높은 다공성을 특징으로 하며, 이는 최소 침습세포 전달을 향한 세포 부착 및 성장에 특히 관심이 있습니다9. 이러한 측면의 관점에서, 다양한 생체적합성 재료가 PM(10, 11)을 제조하기 위해 사용되었다. 세포와 공동 배양된 이들 설계가능한 PM은 우수한 접착력, 상당한 기계적 강도 및 고도로 상호 연결된 윈도우를 제공하여 손상된 조직을 복구하기 위한 세포 증식을 개선할 수 있다12. 이와 관련하여, 다공성 구체(13,14)를 제작하기 위한 다양한 기술들이 또한 개발되었다. 한편으로, PM은 불충분한 상호연결성15,16,17로 인해 억제된NH4HCO3와 같은 가스 형성제를 사용하여 제조되었다. 반면에, PM은 유화 후 직접 전단되어 다중 분산 PM18을 유도했다. 결국, 에멀젼-템플릿화 접근법에 기초한 액적 마이크로유체 기술은 종종 균일한 크기의 입자(19)를 생성하기 때문에 PM을 구축하기 위한 효율적인 방법일 것이다. 특히, 마이크로스피어의 형태학적 특성은 종종 생성된 에멀젼 액적(즉, 유중수, W/O 또는 수중유, O/W)의 품질에 의존하며, 이는 생체 재료(20)의 속성에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 미리 설계된 미세유체 플랫폼을 적용하여 극세사 또는 미세구를 생성할 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 한 예에서, Yu 등은 모세관-기반 미세유체 플랫폼에 기초한 세포-함유 미세섬유 구조의 생산을 입증하였으며, 이는 천연 조직을 모방하기 위한 세포 네트워크를 조립하는데 사용될 수 있다(21). 다른 예에서, Ye 등은 마이크로유체 기술을 통한 실리카 콜로이드 결정 비드의 주형 복제에 의해 광결정 마이크로캡슐을 제조했으며, 이는 복잡한 라벨링 및 특정 장치(22)를 필요로 하는 현재 기술의 많은 한계를 극복할 수 있다.
실제로 이 기술을 활용하는 이유는 본질적으로 용이하고 정교한 장비가 필요하지 않으며 세포 전달 및 재생 의학 응용 분야를 위한 균일한 크기의 PM을 합성하는 편리함과 같은 다양한 이점 때문입니다. 이러한 맥락에서, 에멀젼-템플릿의 사전 설계된 구성 요소를 사용하여, 높은 다공성 및 상호 연결성을 갖는 PM은 폴리(염화비닐)(PVC) 튜브, 유리 모세관 및 바늘로부터 조립된 미세유체 장치로부터 편리하게 얻을 수 있다. W/O 에멀젼-전구체는 젤라틴 수용액과 PLGA의 유기 용액을 균질화함으로써 제조된다. 에멀젼의 적용가능한 부분을 미세유체 플랫폼에 선택적으로 주입함으로써, 균일한 입자 크기 및 표면 전체에 걸쳐 내부로 상호 연결된 기공을 갖는 PM이 제조된다. 본 프로토콜은 마이크로유체 플랫폼에서 에멀젼 템플릿화에 의해 PLGA-HOPM을 제조하는 것을 목표로 한다. 이 프로토콜은 PLGA-HOPM의 재현 가능한 생산을 허용하며 잠재적으로 조직 공학 및 약물 스크리닝의 관련 분야에 적용될 수 있다고 믿어집니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서는 PLGA 기반 아키텍처, 즉 PLGA-HOPM을 제작하는 효율적인 전략에 대해 설명합니다. PLGA의 용매 휘발을 피하고 에멀젼을 준비하는 동안 초음파 전력을 목표 위치로 부드럽게 조정하는 등 몇 가지 중요한 단계를 신중하게 수행해야합니다. 또한, 20 mL 주사기의 액체 배출구는 유화된 전구체의 상분리를 해결하기 위해 어느 정도 조절될 수 있다. 그러나, 제한은 포로겐의 상태가 환경 온도에 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SCL, YW, RKK 및 AZC는 중국 국립 자연 과학 재단(NSFC, 32071323, 81971734 및 U1605225)과 푸젠성 대학의 과학 기술 혁신 연구 팀 프로그램의 재정 지원을 인정합니다. YSZ는 이러한 프로그램의 지원을 받지 않았으며 어떤 유형의 지불도 받지 못했습니다. 대신 브리검 연구소의 지원을 인정합니다.
Materials
| Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
| Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
| Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
| DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
| Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
| Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
| Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
| Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
| Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
| Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
| Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
| Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
| PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
| Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
| Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
| Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
| Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
| Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
| Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
| UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |
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