कार्यात्मक अध्ययन के लिए मानव सिनैप्टिक रिसेप्टर्स को पुन: सक्रिय करने के लिए सिनैप्टिक झिल्ली का माइक्रोट्रांसप्लांटेशन
Summary
प्रोटोकॉल दर्शाता है कि ज़ेनोपस लेविस ओओसाइट्स में सिनैप्टिक झिल्ली के माइक्रोट्रांसप्लांटेशन का प्रदर्शन करके, α-एमिनो-3-हाइड्रॉक्सी-5-मिथाइल-4-आइसोक्साज़ोलेप्रोपियोनिक एसिड और γ-एमिनोब्यूट्रिक एसिड रिसेप्टर्स की सुसंगत और विश्वसनीय प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करना संभव है।
Abstract
उत्तेजक और निरोधात्मक आयनोट्रोपिक रिसेप्टर्स आयन प्रवाह के प्रमुख द्वार हैं जो शारीरिक न्यूरोनल संचार के दौरान सिनैप्स की गतिविधि को निर्धारित करते हैं। इसलिए, अन्य अन्तर्ग्रथनी तत्वों के साथ उनकी बहुतायत, कार्य और संबंधों में परिवर्तन को मस्तिष्क समारोह में परिवर्तन और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों और मानसिक विकारों में संज्ञानात्मक हानि के एक प्रमुख सहसंबंध के रूप में देखा गया है। यह समझना कि उत्तेजक और निरोधात्मक अन्तर्ग्रथनी रिसेप्टर्स के कार्य को बीमारी से कैसे बदल दिया जाता है, प्रभावी उपचारों के विकास के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है। रोग-प्रासंगिक जानकारी प्राप्त करने के लिए, न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स की विद्युत गतिविधि को रिकॉर्ड करना महत्वपूर्ण है जो रोगग्रस्त मानव मस्तिष्क में कार्यात्मक रहते हैं। अब तक यह रिसेप्टर्स के कार्य में रोग संबंधी परिवर्तनों का आकलन करने के लिए निकटतम दृष्टिकोण है। इस काम में, सिनैप्टिक झिल्ली के माइक्रोट्रांसप्लांटेशन करने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत की जाती है, जिसमें मानव रिसेप्टर्स युक्त स्नैप जमे हुए मानव मस्तिष्क के ऊतकों से सिनैप्टिक झिल्ली को फिर से सक्रिय करना शामिल है, इसके इंजेक्शन और पीछे के संलयन द्वारा ज़ेनोपस लेविस ओओसाइट्स की झिल्ली में। प्रोटोकॉल α-एमिनो-3-हाइड्रॉक्सी-5-मिथाइल-4-आइसोक्साज़ोलेप्रोपियोनिक एसिड (एएमपीए) और γ-एमिनोब्यूट्रिक एसिड (जीएबीए) रिसेप्टर्स की सुसंगत और विश्वसनीय प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने के लिए पद्धतिगत रणनीति भी प्रदान करता है, साथ ही उपन्यास विस्तृत तरीके जो सामान्यीकरण और कठोर डेटा विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाते हैं।
Introduction
न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार आबादी के एक बड़े प्रतिशत को प्रभावित करते हैं। यद्यपि उनके विनाशकारी परिणाम अच्छी तरह से ज्ञात हैं, न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स के कार्यात्मक परिवर्तनों के बीच की कड़ी, जो मस्तिष्क समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं, और उनके रोगसूचकता अभी भी खराब समझ में आती है। अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता, रोग की पुरानी प्रकृति, और लक्षणों की कपटी शुरुआत कुछ ऐसे कारण हैं जिन्होंने कई मस्तिष्क विकारों की समझ में देरी की है जहां रासायनिक असंतुलन अच्छी तरह से प्रलेखित हैं 1,2. पशु मॉडल ने अमूल्य जानकारी उत्पन्न की है और विकासवादी संरक्षित प्रणालियों में शरीर विज्ञान और पैथोफिजियोलॉजी अंतर्निहित तंत्र के बारे में हमारे ज्ञान का विस्तार किया है; हालांकि, कृन्तकों और मनुष्यों के बीच कई अंतर-प्रजातियां पशु मॉडल से मानव मस्तिष्क तक रिसेप्टर फ़ंक्शन के प्रत्यक्ष एक्सट्रपलेशन को रोकतीहैं 3. इस प्रकार, देशी मानव रिसेप्टर्स का अध्ययन करने के प्रारंभिक प्रयासरिकार्डो मिलेदी की प्रयोगशाला द्वारा शल्य चिकित्सा द्वारा हटाए गए ऊतक और जमे हुए नमूनों का उपयोग करके विकसित किए गए थे। इन प्रारंभिक प्रयोगों में पूरे झिल्ली का उपयोग किया गया था जिसमें न्यूरोनल सिनैप्टिक और अतिरिक्त सिनैप्टिक रिसेप्टर्स के साथ-साथ गैर-न्यूरोनल न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स शामिल हैं, और हालांकि वे रोगग्रस्त राज्यों के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं, एक चिंता है कि रिसेप्टर्स का मिश्रण डेटा 4,5,6,7 की व्याख्या को जटिल करता है। महत्वपूर्ण रूप से, सिनैप्स कई न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों 8,9 में प्रमुख लक्ष्य हैं; इसलिए, प्रभावित सिनैप्स के कार्यात्मक गुणों का परीक्षण करने के लिए परख सिनैप्टिक संचार को प्रभावित करने वाले रोग-प्रासंगिक परिवर्तनों के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए मौलिक हैं। यहां, मूल विधि के एक संशोधन का वर्णन किया गया है: सिनैप्टिक झिल्ली (एमएसएम) का माइक्रोट्रांसप्लांटेशन, जो समृद्ध सिनैप्टिक प्रोटीन तैयारी के शारीरिक लक्षण वर्णन पर केंद्रित है और चूहे और मानव सिनैप्टोसोम 10,11,12,13,14,15 का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है . इस पद्धति के साथ, सिनैप्टिक रिसेप्टर्स को प्रत्यारोपित करना संभव है जो एक बार मानव मस्तिष्क में काम कर रहे थे, अपने स्वयं के मूल लिपिड में एम्बेडेड और संबंधित प्रोटीन के अपने स्वयं के समूह के साथ। इसके अलावा, क्योंकि एमएसएम डेटा मात्रात्मक है, इसलिए बड़े प्रोटिओमिक या अनुक्रमण डेटासेट10 के साथ एकीकृत करने के लिए इस डेटा का उपयोग करना संभव है।
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सिनैप्टिक रिसेप्टर्स के कई औषधीय और बायोफिजिकल विश्लेषण पुनः संयोजक प्रोटीन16,17 पर किए जाते हैं। हालांकि यह दृष्टिकोण रिसेप्टर्स के संरचना-कार्य संबंधों में बेहतर अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, यह न्यूरॉन्स में पाए जाने वाले जटिल मल्टीमेरिक रिसेप्टर परिसरों और बीमारी में उनके परिवर्तनों के बारे में जानकारी प्रदान नहीं कर सकता है। इसलिए, देशी और पुनः संयोजक प्रोटीन का संयोजन सिनैप्टिक रिसेप्टर्स का अधिक व्यापक विश्लेषण प्रदान करना चाहिए।
सिनैप्टोसोम10,11,12,13,14,15 तैयार करने के कई तरीके हैं जिन्हें प्रयोगशाला की आवश्यकताओं के लिए समायोजित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल इस धारणा के साथ शुरू होता है कि सिनैप्टोसोमल समृद्ध तैयारी अलग-थलग थी और माइक्रोट्रांसप्लांटेशन प्रयोगों के लिए संसाधित होने के लिए तैयार हैं। प्रयोगशाला में, निर्माता निर्देशों का पालन करते हुए सिन-प्रति विधि का उपयोग किया जाता है। यह इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों10,11 में उच्च प्रजनन क्षमता के कारण किया जाता है। ज़ेनोपस ओओसाइट्स18,19 को अलग करने के तरीके को समझाते हुए प्रचुर मात्रा में साहित्य भी है, जिसे इंजेक्शन20 के लिए तैयार भी खरीदा जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मस्तिष्क विकारों में होमियोस्टैटिक और रोग प्रक्रियाओं को समझने और बीमारियों को रोकने या इलाज के लिए चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए मानव मस्तिष्क से देशी प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण आवश्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एनआईएच अनुदान आर01एजी070255 और एएल को आर01एजी073133 द्वारा समर्थित किया गया था। हम इस पांडुलिपि में दिखाए गए मानव ऊतक प्रदान करने के लिए कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय इरविन अल्जाइमर रोग अनुसंधान केंद्र (यूसीआई-एडीआरसी) को भी धन्यवाद देते हैं। यूसीआई-एडीआरसी को एनआईएच/एनआईए अनुदान पी30 एजी066519 द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।
Materials
| For Microinjection | |||
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| 24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
| Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
| Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
| Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
| Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
| Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
| Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
| For Two Electrode Voltage clamp | |||
| 15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
| Any PC computer or laptop | |||
| Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
| ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
| WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
| X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
| Reagents | |||
| Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
| Kainic acid | Tocris | 0222 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
| Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
| Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
| Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |
References
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