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Neuroscience

機能研究のためのヒトシナプス受容体を再活性化するためのシナプス膜の微小移植

Published: July 20, 2022
doi:
10.3791/64024
, , ,
1The Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, Department of Neurology,University of Texas Medical Branch

Summary

このプロトコルは、アフリカ ツメガエル・ラエビス 卵母細胞へのシナプス膜の微小移植を行うことによって、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸およびγ-アミノ酪酸受容体の一貫した信頼性の高い応答を記録することが可能であることを実証する。

Abstract

興奮性および抑制性のイオントロピック受容体は、生理学的ニューロン通信中のシナプスの活性を決定するイオンフラックスの主要なゲートである。したがって、それらの存在量、機能、および他のシナプス要素との関係の変化は、神経変性疾患および精神障害における脳機能および認知障害の変化の主要な相関として観察されている。興奮性および抑制性シナプス受容体の機能が疾患によってどのように変化するかを理解することは、効果的な治療法の開発にとって極めて重要である。疾患関連情報を得るためには、罹患したヒトの脳内で機能し続ける神経伝達物質受容体の電気的活動を記録することが重要である。これまでのところ、これは受容体の機能における病理学的変化を評価するための最も近いアプローチである。本研究では、ヒト受容体を含むスナップ凍結ヒト脳組織からシナプス膜を再活性化するシナプス膜を、アフリカツ メガ エルの卵母細胞の膜への注入と後部融合により微細移植する方法論を提示する。このプロトコルはまた、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸(AMPA)およびγ-アミノ酪酸(GABA)受容体の一貫した信頼性の高い応答を得るための方法論的戦略、ならびに正規化および厳密なデータ分析に使用される新規な詳細な方法を提供する。

Introduction

神経変性障害は、人口の大部分に影響を及ぼす。それらの壊滅的な結果はよく知られていますが、脳機能にとって重要な神経伝達物質受容体の機能的変化とそれらの症状との間の関連性はまだほとんど理解されていません。個人間の変動性、疾患の慢性的な性質、および症状の狡猾な発症は、化学的不均衡が十分に文書化されている多くの脳障害の理解を遅らせた理由のほんの一部です1,2。動物モデルは、非常に貴重な情報を生み出し、進化保存系における生理学と病態生理学の根底にあるメカニズムに関する知識を広げました。しかし、げっ歯類とヒトとの間のいくつかの種間差異は、動物モデルからヒト脳への受容体機能の直接的な外挿を妨げている3。したがって、天然のヒト受容体を研究するための最初の努力は、外科的に除去された組織および凍結サンプルを使用して、Ricardo Milediの研究室によって開発された。これらの初期の実験では、ニューロンシナプス受容体および余分なシナプス受容体ならびに非ニューロン神経伝達物質受容体を含む全膜を使用し、それらは罹患状態に関する重要な情報を提供するが、受容体の混合がデータの解釈を複雑にする懸念がある4、5、6、7。重要なことに、シナプスは多くの神経変性疾患における主要な標的である8,9;したがって、罹患したシナプスの機能特性を試験するためのアッセイは、シナプス通信に影響を及ぼす疾患関連の変化に関する情報を得るための基本である。ここで、元の方法の改変が記載されている:濃縮シナプスタンパク質調製物の生理学的特徴付けに焦点を当て、研究ラットおよびヒトシナプトソームに首尾よく適用されたシナプス膜(MSM)の微小移植10,11,12,13,14,15.この方法論により、かつてヒトの脳内で働いていたシナプス受容体を移植し、独自の天然脂質に埋め込み、関連するタンパク質の独自のコホートを移植することが可能である。さらに、MSMデータは定量的であるため、このデータを使用して、大規模なプロテオームまたはシーケンシングデータセット10と統合することができる。

シナプス受容体の多くの薬理学的および生物物理学的分析が組換えタンパク質に対して行われていることに注意することが重要です16,17。このアプローチは、受容体の構造と機能の関係についてのより良い洞察を提供するが、ニューロンに見られる複雑な多量体受容体複合体およびそれらの疾患の変化に関する情報を提供することはできない。したがって、天然タンパク質と組換えタンパク質の組み合わせは、シナプス受容体のより包括的な分析を提供するはずである。

シナプトソーム10,11,12,13,14,15を調製する方法は数多くあり、ラボの要件に合わせて調整することができます。このプロトコルは、シナプトソーム富化調製物が単離され、微小移植実験のために処理される準備ができているという仮定から始まる。ラボでは、製造元の指示に従って Syn-Per メソッドが使用されます。これは、電気生理学的実験10、11において再現性が高いためである。アフリカツメガエル卵母細胞18、19を単離する方法を説明する豊富な文献もあり、注射20の準備ができて購入することもできる。

Protocol

すべての研究は、施設のガイドラインに準拠して行われ、カリフォルニア大学アーバイン校(IACUC-1998-1388)およびテキサス大学医学部(IACUC-1803024)の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されています。非アルツハイマー病(AD)脳(女性、74歳、死後間隔2.8時間)およびAD脳(女性、74歳、死後間隔4.5時間)からの側頭皮質は、カリフォルニア大学アーバインアルツハイマー病研究センター(UCI-ADRC)?…

Representative Results

注射後数時間以内に、神経伝達物質受容体およびイオンチャネルを運ぶシナプス膜は、卵母細胞原形質膜と融合し始める。図1は、アフリカツメガエル卵母細胞に微小移植されたAMPAおよびGABAA受容体の記録を示す。ほとんどの分析において、異なるカエル由来の卵母細胞の2つまたは3つのバッチを使用して、サンプルあたり合計6〜9個の卵母細胞について、…

Discussion

ヒトの脳からの天然タンパク質複合体の分析は、脳障害における恒常性および病理学的プロセスを理解し、疾患を予防または治療するための治療戦略を開発するために必要である。したがって、スナップ凍結サンプルを含む脳バンクは、大規模でほとんど未開発の豊富な生理学的情報の非常に貴重な情報源である29,30。死後組織を使用するための最…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、NIA/NIHのALへのR01AG070255およびR01AG073133の助成金によって支援された。我々はまた、この原稿に示されたヒト組織を提供してくれたカリフォルニア大学アーバイン・アルツハイマー病研究センター(UCI-ADRC)にも感謝する。UCI-ADRCは、NIH/NIA助成金P30 AG066519によって資金提供されています。

Materials

For Microinjection
3.5" Glass Capillaries Drummond 3-000-203-G/X
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate Thermofisher FB012929
Flaming/Brown type micropipette puller Sutter P-1000
Injection Dish Thermofisher 08-772B
Microcentrifuge Tubes Thermofisher 02-682-002
Mineral Oil Thermofisher O121-1
Nanoject II Drummond 3-000-204
Nylon mesh Industrial Netting WN0800
Parafilm Thermofisher S37440
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Syringe Thermofisher 14-841-31
Ultrasonic cleaning bath Thermofisher FS20D
Xenopus laevis frogs Xenopus 1 4217
For Two Electrode Voltage clamp
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries Sutter B200-116-15
Any PC computer or laptop
Low-pass Bessel Filter Warner Instruments LPF-8
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Two electrode voltage clamp workstation Warner Instruments TEV-700
ValveLink 8.2 Perfusion Controller Automate Scientific SKU:01-18
WInEDR Free software University of Strathclyde Glasgow https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X Series Multifunction DAQ National Instruments NI USB-6341
Reagents
Calcium dichloride Thermofisher C79
Calcium nitrate tetrahydrate Thermofisher C109
Collagenase Sigma-Aldrich C0130
GABA Sigma-Aldrich A2129
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) Thermofisher BP310
Kainic acid Tocris 0222
Magnesium sulfate heptahydrate Thermofisher M63
Potassium chloride Thermofisher P217
Sodium bicarbonate Thermofisher S233
Sodium chloride Thermofisher S271-1
Ultrafree-0.1 µm MC filter, Amicon
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References

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Miller, B., Powell, A., Gutierrez, B. A., Limon, A. Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies. J. Vis. Exp. (185), e64024, doi:10.3791/64024 (2022).
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