Mikrotransplantasjon av synaptiske membraner for å reaktivere humane synaptiske reseptorer for funksjonelle studier

Summary

Protokollen viser at ved å utføre mikrotransplantasjon av synaptiske membraner i Xenopus laevis oocytter, er det mulig å registrere konsistente og pålitelige responser av α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoxazolepropionic acid og γ-aminosmørsyre reseptorer.

Abstract

Eksitatoriske og hemmende ionotrope reseptorer er de viktigste portene til ionflukser som bestemmer aktiviteten til synapser under fysiologisk nevronkommunikasjon. Derfor har endringer i deres overflod, funksjon og forhold til andre synaptiske elementer blitt observert som en stor korrelasjon av endringer i hjernefunksjon og kognitiv svikt i nevrodegenerative sykdommer og psykiske lidelser. Å forstå hvordan funksjonen til eksitatoriske og hemmende synaptiske reseptorer endres av sykdom, er av avgjørende betydning for utviklingen av effektive terapier. For å få sykdomsrelevant informasjon er det viktig å registrere den elektriske aktiviteten til nevrotransmitterreseptorer som forblir funksjonelle i den syke menneskelige hjernen. Så langt er dette den nærmeste tilnærmingen til å vurdere patologiske endringer i reseptorens funksjon. I dette arbeidet presenteres en metodikk for å utføre mikrotransplantasjon av synaptiske membraner, som består av reaktivering av synaptiske membraner fra snapfrossen humant hjernevev som inneholder menneskelige reseptorer, ved injeksjon og bakre fusjon i membranen til Xenopus laevis oocytter. Protokollen gir også den metodologiske strategien for å oppnå konsistente og pålitelige responser av α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) og γ-aminosmørsyre (GABA) reseptorer, samt nye detaljerte metoder som brukes til normalisering og streng dataanalyse.

Introduction

Nevrodegenerative lidelser påvirker en stor prosentandel av befolkningen. Selv om deres ødeleggende konsekvenser er velkjente, er koblingen mellom de funksjonelle endringene av nevrotransmitterreseptorer, som er kritiske for hjernefunksjonen, og symptomatologien deres fortsatt dårlig forstått. Inter-individuell variasjon, kronisk natur av sykdommen, og lumsk utbrudd av symptomer er bare noen av grunnene som har forsinket forståelsen av de mange hjernesykdommer der kjemiske ubalanser er godt dokumentert ^1,2. Dyremodeller har generert uvurderlig informasjon og utvidet vår kunnskap om mekanismene underliggende fysiologi og patofysiologi i evolusjonære bevarte systemer; Imidlertid utelukker flere interspecies forskjeller mellom gnagere og mennesker direkte ekstrapolering av reseptorfunksjon fra dyremodeller til den menneskelige hjerne³. Dermed ble innledende innsats for å studere innfødte menneskelige reseptorer utviklet av Ricardo Miledis laboratorium ved hjelp av kirurgisk fjernet vev og frosne prøver. Disse første eksperimentene brukte hele membraner som inkluderer nevronal synaptiske og ekstra synaptiske reseptorer samt ikke-nevronale nevrotransmitterreseptorer, og selv om de gir viktig informasjon om syke tilstander, er det en bekymring for at blandingen av reseptorer kompliserer tolkningen av data 4,5,6,7. Viktigst, synapser er hovedmålet i mange nevrodegenerative lidelser ^8,9; Derfor er analyser for å teste de funksjonelle egenskapene til berørte synapser grunnleggende for å få informasjon om sykdomsrelevante endringer som påvirker synaptisk kommunikasjon. Her er en modifikasjon av den opprinnelige metoden beskrevet: mikrotransplantasjon av synaptiske membraner (MSM), som fokuserer på fysiologisk karakterisering av berikede synaptiske proteinpreparater og har blitt brukt til å studere rotte og menneskelige synaptosomer 10,11,12,13,14,15 . Med denne metodikken er det mulig å transplantere synaptiske reseptorer som en gang jobbet i den menneskelige hjerne, innebygd i sine egne innfødte lipider og med sin egen kohort av tilknyttede proteiner. Fordi MSM-data er kvantitative, er det dessuten mulig å bruke disse dataene til å integrere med store proteomiske datasett eller sekvenseringsdatasett¹⁰.

Det er viktig å merke seg at mange farmakologiske og biofysiske analyser av synaptiske reseptorer gjøres på rekombinante proteiner ^16,17. Selv om denne tilnærmingen gir bedre innsikt i strukturfunksjonsforholdene til reseptorer, kan den ikke gi informasjon om komplekse multimeriske reseptorkomplekser som finnes i nevroner og deres endringer i sykdom. Derfor bør en kombinasjon av innfødte og rekombinante proteiner gi en mer omfattende analyse av synaptiske reseptorer.

Det er mange metoder for å forberede synaptosomer 10,11,12,13,14,15 som kan justeres for kravene til et laboratorium. Protokollen begynner med antagelsen om at synaptosomale berikede preparater ble isolert og er klare til å bli behandlet for mikrotransplantasjonsforsøk. I laboratoriet brukes Syn-Per-metoden i henhold til produsentens instruksjoner. Dette gjøres på grunn av høy reproduserbarhet i elektrofysiologiske eksperimenter^10,11. Det er også rikelig litteratur som forklarer hvordan man isolerer Xenopus oocytter^18,19, som også kan kjøpes klar til injeksjon²⁰.

Protocol

All forskning utføres i samsvar med institusjonelle retningslinjer og godkjennes av den institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteen ved University of California Irvine (IACUC-1998-1388) og University of Texas Medical Branch (IACUC-1803024). Temporal cortex fra en ikke-Alzheimers sykdom (AD) hjerne (kvinne, 74 år gammel, postmortem intervall 2,8 h) og en AD-hjerne (kvinne, 74 år gammel, postmortem intervall 4,5 h) ble gitt av University of California Irvine Alzheimers sykdomsforskningssenter (UCI-ADRC). Informert samty…

Representative Results

Innen få timer etter injeksjon begynner de synaptiske membranene, som bærer sine nevrotransmitterreseptorer og ionkanaler, å smelte sammen med oocyttplasmamembranen. Figur 1 viser opptak av AMPA- og GABAA-reseptorer mikrotransplantet til Xenopus oocytter. For det meste av analysen ble svarene fra to eller tre oocytter per prøve målt ved hjelp av to eller tre partier oocytter fra forskjellige frosker, totalt seks til ni oocytter per prøve. Dette gjøres for en stor k…

Discussion

Analyse av innfødte proteinkomplekser fra menneskelige hjerner er nødvendig for å forstå homeostatiske og patologiske prosesser i hjernesykdommer og utvikle terapeutiske strategier for å forebygge eller behandle sykdommer. Dermed er hjernebanker som inneholder snap frosne prøver en uvurderlig kilde til en stor og for det meste uutnyttet rikdom av fysiologisk informasjon^29,30. En første bekymring for å bruke postmortem vev er den klare muligheten for mRNA …

Materials

For Microinjection
3.5" Glass Capillaries	Drummond	3-000-203-G/X
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate	Thermofisher	FB012929
Flaming/Brown type micropipette puller	Sutter	P-1000
Injection Dish	Thermofisher	08-772B
Microcentrifuge Tubes	Thermofisher	02-682-002
Mineral Oil	Thermofisher	O121-1
Nanoject II	Drummond	3-000-204
Nylon mesh	Industrial Netting	WN0800
Parafilm	Thermofisher	S37440
Stereoscope	Fisher Scientific	03-000-037
Syringe	Thermofisher	14-841-31
Ultrasonic cleaning bath	Thermofisher	FS20D
Xenopus laevis frogs	Xenopus 1	4217
For Two Electrode Voltage clamp
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries	Sutter	B200-116-15
Any PC computer or laptop
Low-pass Bessel Filter	Warner Instruments	LPF-8
Stereoscope	Fisher Scientific	03-000-037
Two electrode voltage clamp workstation	Warner Instruments	TEV-700
ValveLink 8.2 Perfusion Controller	Automate Scientific	SKU:01-18
WInEDR Free software	University of Strathclyde Glasgow	https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X Series Multifunction DAQ	National Instruments	NI USB-6341
Reagents
Calcium dichloride	Thermofisher	C79
Calcium nitrate tetrahydrate	Thermofisher	C109
Collagenase	Sigma-Aldrich	C0130
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)	Thermofisher	BP310
Kainic acid	Tocris	0222
Magnesium sulfate heptahydrate	Thermofisher	M63
Potassium chloride	Thermofisher	P217
Sodium bicarbonate	Thermofisher	S233
Sodium chloride	Thermofisher	S271-1
Ultrafree-0.1 µm MC filter,	Amicon