Mikrotransplantation av synaptiska membran för att återaktivera humana synaptiska receptorer för funktionella studier
Summary
Protokollet visar att genom att utföra mikrotransplantation av synaptiska membran i Xenopus laevis-oocyter är det möjligt att registrera konsekventa och tillförlitliga svar av α-amino-3-hydroxi-5-metyl-4-isoxazolpropionsyra och γ-aminosmörsyrareceptorer.
Abstract
Excitatoriska och hämmande jonotropa receptorer är de viktigaste portarna av jonflöden som bestämmer synapsernas aktivitet under fysiologisk neuronal kommunikation. Därför har förändringar i deras överflöd, funktion och relationer med andra synaptiska element observerats som ett viktigt korrelat av förändringar i hjärnfunktion och kognitiv försämring vid neurodegenerativa sjukdomar och psykiska störningar. Att förstå hur funktionen hos excitatoriska och hämmande synaptiska receptorer förändras av sjukdom är av avgörande betydelse för utvecklingen av effektiva terapier. För att få sjukdomsrelevant information är det viktigt att registrera den elektriska aktiviteten hos neurotransmittorreceptorer som förblir funktionella i den sjuka mänskliga hjärnan. Hittills är detta det närmaste tillvägagångssättet för att bedöma patologiska förändringar i receptorernas funktion. I detta arbete presenteras en metod för att utföra mikrotransplantation av synaptiska membran, som består av att återaktivera synaptiska membran från snapfryst mänsklig hjärnvävnad innehållande humana receptorer, genom dess injektion och bakre fusion i membranet av Xenopus laevis-oocyter . Protokollet tillhandahåller också den metodologiska strategin för att erhålla konsekventa och tillförlitliga svar av α-amino-3-hydroxi-5-metyl-4-isoxazolpropionsyra (AMPA) och γ-aminosmörsyra (GABA) receptorer, samt nya detaljerade metoder som används för normalisering och rigorös dataanalys.
Introduction
Neurodegenerativa störningar påverkar en stor andel av befolkningen. Även om deras förödande konsekvenser är välkända, är kopplingen mellan de funktionella förändringarna av neurotransmittorreceptorer, som är kritiska för hjärnfunktionen, och deras symptomatologi fortfarande dåligt förstådd. Interindividuell variabilitet, sjukdomens kroniska natur och lömsk debut av symtom är bara några av orsakerna som har försenat förståelsen av de många hjärnsjukdomar där kemiska obalanser är väl dokumenterade 1,2. Djurmodeller har genererat ovärderlig information och utökat vår kunskap om mekanismerna bakom fysiologi och patofysiologi i evolutionära bevarade system; emellertid utesluter flera skillnader mellan arter mellan gnagare och människor direkt extrapolering av receptorfunktionen från djurmodeller till den mänskliga hjärnan3. Således utvecklades initiala ansträngningar för att studera inhemska mänskliga receptorer av Ricardo Miledis laboratorium med kirurgiskt borttagen vävnad och frysta prover. Dessa initiala experiment använde hela membran som inkluderar neuronala synaptiska och extra synaptiska receptorer såväl som icke-neuronala neurotransmittorreceptorer, och även om de ger viktig information om sjuka tillstånd, finns det en oro för att blandningen av receptorer komplicerar tolkningen av data 4,5,6,7. Viktigt är att synapser är det viktigaste målet i många neurodegenerativa störningar 8,9; Därför är analyser för att testa de funktionella egenskaperna hos drabbade synapser grundläggande för att få information om sjukdomsrelevanta förändringar som påverkar synaptisk kommunikation. Här beskrivs en modifiering av den ursprungliga metoden: mikrotransplantation av synaptiska membran (MSM), som fokuserar på den fysiologiska karakteriseringen av berikade synaptiska proteinpreparat och har framgångsrikt tillämpats för att studera råtta och humana synaptosomer 10,11,12,13,14,15 . Med denna metod är det möjligt att transplantera synaptiska receptorer som en gång arbetade i den mänskliga hjärnan, inbäddade i sina egna inhemska lipider och med sin egen kohort av associerade proteiner. Eftersom MSM-data är kvantitativa är det dessutom möjligt att använda dessa data för att integrera med stora proteomiska eller sekvenseringsdatauppsättningar10.
Det är viktigt att notera att många farmakologiska och biofysiska analyser av synaptiska receptorer görs på rekombinanta proteiner 16,17. Även om detta tillvägagångssätt ger bättre inblick i struktur-funktion relationer av receptorer, det kan inte ge information om komplexa multimera receptorkomplex som finns i nervceller och deras förändringar i sjukdom. Därför bör en kombination av inhemska och rekombinanta proteiner ge en mer omfattande analys av synaptiska receptorer.
Det finns många metoder för att förbereda synaptosomer 10,11,12,13,14,15 som kan justeras för kraven i ett laboratorium. Protokollet börjar med antagandet att synaptosomala berikade preparat isolerades och är redo att bearbetas för mikrotransplantationsexperiment. I labbet används Syn-Per-metoden enligt tillverkarens instruktioner. Detta görs på grund av hög reproducerbarhet i elektrofysiologiska experiment 10,11. Det finns också riklig litteratur som förklarar hur man isolerar Xenopus-oocyter 18,19, som också kan köpas redo för injektion20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analys av inhemska proteinkomplex från mänskliga hjärnor behövs för att förstå homeostatiska och patologiska processer vid hjärnsjukdomar och utveckla terapeutiska strategier för att förebygga eller behandla sjukdomar. Således är hjärnbanker som innehåller snapfrysta prover en ovärderlig källa till en stor och mestadels outnyttjad mängd fysiologisk information29,30. Ett första problem med att använda postmortemvävnad är den tydliga möjlighet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIA/NIH-bidrag R01AG070255 och R01AG073133 till AL. Vi tackar också University of California Irvine Alzheimers sjukdom research center (UCI-ADRC) för att ha tillhandahållit den mänskliga vävnaden som visas i detta manuskript. UCI-ADRC finansieras av NIH/NIA-bidrag P30 AG066519.
Materials
| For Microinjection | |||
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| 24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
| Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
| Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
| Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
| Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
| Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
| Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
| For Two Electrode Voltage clamp | |||
| 15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
| Any PC computer or laptop | |||
| Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
| ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
| WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
| X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
| Reagents | |||
| Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
| Kainic acid | Tocris | 0222 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
| Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
| Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
| Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |
References
- Furcila, D., Defelipe, J., Alonso-Nanclares, L. A study of amyloid-β and phosphotau in plaques and neurons in the hippocampus of Alzheimer’s disease patients. Journal of Alzheimer’s Disease. 64 (2), 417-435 (2018).
- Varol, E., Sotiras, A., Davatzikos, C. HYDRA: revealing Heterogeneity of imaging and genetic patterns through a multiple max-margin discriminative analysis framework. Neuroimaje. 145, 346-364 (2017).
- Hodge, R. v. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Wu, J., et al. GABAA receptor-mediated excitation in dissociated neurons from human hypothalamic hamartomas. Experimental Neurology. 213 (2), 397-404 (2008).
- Miledi, R., Eusebi, F., Martínez-Torres, A., Palma, E., Trettel, F. Expression of functional neurotransmitter receptors in Xenopus oocytes after injection of human brain membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 13238-13242 (2002).
- Zwart, R., Mazzo, F., Sher, E. Microtransplantation of human brain receptors into oocytes to tackle key questions in drug discovery. Drug Discovery Today. 24 (2), 533-543 (2019).
- Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Miledi, R. Microtransplantation of neurotransmitter receptors from postmortem autistic brains to Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10973-10977 (2008).
- Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
- Taoufik, E., Kouroupi, G., Zygogianni, O., Matsas, R. Synaptic dysfunction in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases: An overview of induced pluripotent stem-cell-based disease models. Open Biology. 8 (9), 180138 (2018).
- Zeppillo, T., et al. Functional impairment of cortical AMPA receptors in schizophrenia. Schizophrenia Research. , (2020).
- Lauterborn, J. C., et al. Increased excitatory to inhibitory synaptic ratio in parietal cortex samples from individuals with Alzheimer’s disease. Nature Communications. 12 (1), 2603 (2021).
- Mazzo, F., et al. Reconstitution of synaptic Ion channels from rodent and human brain in Xenopus oocytes: a biochemical and electrophysiological characterization. Journal of Neurochemistry. 138 (3), 384-396 (2016).
- Sanna, E., et al. Expression of native GABA(A) receptors in Xenopus oocytes injected with rat brain synaptosomes. Journal of Neurochemistry. 67 (5), 2212-2214 (1996).
- Sanna, E., et al. Functional changes in rat nigral GABA(A) receptors induced by degeneration of the striatonigral GABAergic pathway: An electrophysiological study of receptors incorporated into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 70 (6), 2539-2544 (1998).
- Sandoval, M., et al. Antagonistic effects of TrkB and p75NTR on NMDA receptor currents in post-synaptic densities transplanted into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 101 (6), 1672-1684 (2007).
- Perrais, D., Pinheiro, P. S., Jane, D. E., Mulle, C. Antagonism of recombinant and native GluK3-containing kainate receptors. Neuropharmacology. 56 (1), 131-140 (2009).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364 (6438), 355-362 (2019).
- Bröer, S. Xenopus laevis Oocytes. Membrane Transporters in Drug Discovery and Development: Methods and Protocols. , 295-310 (2010).
- Newman, K., Aguero, T., King, M. Lou Isolation of xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (2), 86-91 (2018).
- Lin-Moshier, Y., Marchant, J. S. The Xenopus oocyte: A single-cell model for studying Ca2+ signaling. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (3), 185-191 (2013).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Microinjection of Xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Eusebi, F., Palma, E., Amici, M., Miledi, R. Microtransplantation of ligand-gated receptor-channels from fresh or frozen nervous tissue into Xenopus oocytes: A potent tool for expanding functional information. Progress in Neurobiology. 88 (1), 32-40 (2009).
- Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 5224-5228 (1995).
- Cutting, G. R., et al. Cloning of the γ-aminobutyric acid (GABA) ρ1 cDNA: A GABA receptor subunit highly expressed in the retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (7), 2673-2677 (1991).
- Calvo, D. J., Vazquez, A. E., Miledi, R. Cationic modulation of ρ1-type γ-aminobutyrate receptors expressed in Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 12725-12729 (1994).
- Martínez-Torres, A., Miledi, R. Expression of γ-aminobutyric acid ρ1 and ρ1Δ450 as gene fusions with the green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 1947-1951 (2001).
- Ochoa-De La Paz, L. D., Estrada-Mondragón, A., Limón, A., Miledi, R., Martínez-Torres, A. Dopamine and serotonin modulate human GABAρ1 receptors expressed in Xenopus laevis oocytes. ACS Chemical Neuroscience. 3 (2), 96-104 (2012).
- Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Eusebi, F., Miledi, R. Properties of GluR3 receptors tagged with GFP at the amino or carboxyl terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (39), 15526-15530 (2007).
- C, S. N. A Rosetta stone for analysis of human membrane protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10641-10642 (2008).
- Eleonora, P., et al. GABAA-current rundown of temporal lobe epilepsy is associated with repetitive activation of GABAA "phasic" receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (52), 20944-20948 (2007).
- Bond, B. C., et al. The quantification of gene expression in an animal model of brain ischaemia using TaqManTM real-time RT-PCR. Molecular Brain Research. 106 (1-2), 101-116 (2002).
- Preece, P., Cairns, N. J. Quantifying mRNA in postmortem human brain: influence of gender, age at death, postmortem interval, brain pH, agonal state and inter-lobe mRNA variance. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 60-71 (2003).
- Preece, P., et al. An optimistic view for quantifying mRNA in post-mortem human brain. Molecular Brain Research. 116 (1-2), 7-16 (2003).
- Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: What quality markers matter. Brain Research. 1123 (1), 1-11 (2006).
- Scaduto, P., Sequeira, A., Vawter, M. P., Bunney, W., Limon, A. Preservation of global synaptic excitatory to inhibitory ratio during long postmortem intervals. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
- Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (11), 5224-5228 (1995).
- Le Mauff, A., et al. Nicotinic acetylcholine receptors in the synganglion of the tick Ixodes ricinus: Functional characterization using membrane microtransplantation. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 14, 144-151 (2020).
- Crespin, L., Legros, C., List, O., Tricoire-Leignel, H., Mattei, C. Injection of insect membrane in Xenopus oocyte: An original method for the pharmacological characterization of neonicotinoid insecticides. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 77, 10-16 (2016).
- Soualah, Z., et al. GABAA Receptor Subunit Composition Drives Its Sensitivity to the Insecticide Fipronil. Frontiers in Neuroscience. 15, 1-13 (2021).
- Symington, S. B., Murenzi, E., Toltin, A. C., Lansky, D., Clark, J. M. Realizing the potential: improving a microtransplantation assay based on neurolemma-injected Xenopus oocytes: an ex vivo approach to study ion channels in their native state. ACS Symposium Series. 1264, 53-73 (2017).
- Palma, E., et al. Microtransplantation of membranes from cultured cells to Xenopus oocytes: A method to study neurotransmitter receptors embedded in native lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2896-2900 (2003).
